槲皮素对肝癌细胞Huh7的杀伤活性研究

张红萍，袁梅

（嘉兴市中医医院，浙江 嘉兴314001）

γδ T细胞是T细胞的一个功能性亚群，其表面的T细胞受体（TCR）由γδ肽链组成。尽管γδ T细胞在T细胞族群中占比很小，但其却能直接杀伤肿瘤细胞而不需要依赖MHC分子。尽管如此，肿瘤细胞对γδ T细胞单独治疗的敏感性却仍较低[1]，因此需辅以其它药物提高γδ T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。本研究目的在于探讨γδ T细胞对肝癌细胞系Huh7的细胞毒性，并研究槲皮素对γδ T细胞的协同效应。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂 槲皮素购于美国Sigma-Aldrich。JC-1线粒体膜电位染料、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒和线粒体分离试剂盒购于江苏碧云天生物技术有限公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，MCL-1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、细胞色素C和GAPDH抗体购于美国Cell Signaling公司。ECL试剂盒购于美国Pierce公司，pcDNA3.1质粒和脂质体2000（Lipofectamine 2000）购于美国Invitrogen公司，溴代醇磷酸 （bromohydrin pyrophosphate，BrHPP）购于法国 Innate Pharma 公司，IL-2购于美国R&D system公司，γδ TCR-PE流式细胞抗体和CD3-FITC流式细胞抗体购于美国BD Bioscience公司。

1.1.2 细胞培养 人肝癌细胞系Huh7购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。γδ T细胞的培养按文献[2]所示，取12例健康志愿者的全血采用密度梯度离心法获取单个核细胞，并培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，加入3μmol/L γδ T细胞特异性扩增剂BrHPP和400U/mL IL-2培养14天。

1.2 实验方法

1.2.1 γδ T细胞的鉴别 培养γδ T细胞用带PE荧光标记的γδ TCR流式细胞抗体和带FITC荧光标记的CD3流式细胞抗体孵育20分钟，用生理盐水将细胞清洗3次后用流式细胞仪进行检测。

1.2.2 MCL-1过表达质粒的构建和转染 将MCL-1基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成MCL-1重组过表达质粒。MCL-1过表达质粒用Lipofectamine 2000按试剂操作说明书步骤进行转染，将2μg/mL MCL-1表达质粒转染入Huh7细胞中。

1.2.3 γδ T细胞的杀伤活性 采用乳酸脱氢酶释放实验。按不同的效靶比（效应γδ T细胞个数：目标Huh7靶细胞个数，E:T），将Huh7细胞和γδ T细胞进行共培养，12小时后用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，按说明书步骤检测Huh7细胞乳酸脱氢酶的释放率。

1.2.4 槲皮素对γδ T细胞杀伤活性的影响 采用乳酸脱氢酶释放实验。实验分为对照组、槲皮素组、γδ T细胞组、槲皮素+γδ T细胞组、槲皮素+γδ T细胞+MCL-1质粒组。各组实验处理方法详见表1。细胞处理完毕后用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，按说明书步骤检测Huh7细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放率。

表1 各组实验处理方法

1.2.5 线粒体膜电位测定 将Huh7细胞按上述进行分组。药物处理完毕后按试剂操作说明书步骤将细胞用JC-1染料进行孵育，孵育完毕后用流式细胞仪检测JC-1发出的红色荧光，红色荧光强度越强，线粒体膜电位越高[3]。

1.2.6 线粒体分离 将Huh7细胞按上述进行分组。用线粒体分离试剂盒按试剂说明书步骤将处理后的Huh7细胞线粒体从细胞质中分离出来，取无线粒体的细胞质进行后续的western blot实验。

1.2.7 Western blot实验 将Huh7细胞按上述进行分组。细胞处理完毕后用蛋白提取液提取Huh7细胞中的总蛋白质，将等量的总蛋白质用12.5%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用MCL-1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、 细胞色素 C和GAPDH抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2小时，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

2 结果

2.1 γδ T细胞对肝癌细胞的杀伤活性 人全血单个核细胞经体外γδ T细胞扩增培养后用流式细胞术进行鉴定，发现γδ T细胞可在体外扩增培养，且培养产物高表达CD3和γδ TCR（图1），将γδ T细胞与Huh7细胞按不同（E:T）混合培养。LDH释放实验结果显示，E:T越高，Huh7细胞的LDH释放率越高，表明γδ T细胞对肝癌细胞有杀伤活性 （表2），且呈γδ T细胞的剂量依赖。

图1 体外培养后γδ T细胞的流式细胞图

2.2 槲皮素提高γδ T细胞对肝癌的细胞毒性LDH释放实验结果显示，γδ T细胞+槲皮素组Huh7的LDH释放率显著高于γδ T细胞组和槲皮素组（表3），表明槲皮素处理能显著提高γδ T细胞对Huh7的细胞毒性。

表2 γδ T细胞对肝癌细胞的杀伤活性 （±s，%）

表2 γδ T细胞对肝癌细胞的杀伤活性 （±s，%）

与对照组比较*P＜0.05，与1.25倍γδ T细胞组比较☆P＜0.05，与 2.5倍 γδ T 细胞组比较△P＜0.05，与 5倍 γδ T 细胞组比较▲P＜0.05

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2.3 槲皮素通过下调MCL-1的表达促进γδ T细胞对Huh7凋亡的诱导活性 Western blot实验结果显示，槲皮素体外处理能显著降低Huh7细胞中MCL-1的表达水平（图2），提示槲皮素对γδ T细胞的增效作用可能和Huh7细胞MCL-1的下调有关。当在Huh7细胞中转染MCL-1质粒后，γδ T细胞联合槲皮素对Huh7的细胞毒性受到明显抑制（表3），表明槲皮素通过下调Huh7细胞中MCL-1蛋白的表达增强γδ T细胞对其的细胞毒性。另外，流式细胞实验显示，槲皮素单独处理不影响线粒体膜电位，但其通过抑制Huh-1的表达促进γδ T细胞依赖的线粒体膜电位下降，说明槲皮素能显著增强γδ T细胞对Huh7细胞线粒体膜电位的损伤（图3），而Western blot实验结果则显示槲皮素抑制MCL-1蛋白的表达显著促进γδ T细胞依赖的细胞色素C的释放和凋亡标志蛋白caspase-9和caspase-3的活化（图2），表明槲皮素通过MCL-1/线粒体途径增强γδ T细胞对肝癌的细胞毒性。

图2 各组MCL-1表达水平

表3 槲皮素增强γδ T细胞对Huh7细胞的细胞毒性（±s）

表3 槲皮素增强γδ T细胞对Huh7细胞的细胞毒性（±s）

与对照组比较*P＜0.05，与槲皮素+γδ T细胞组比较△P＜0.05

组别 n/孔 L D H释放率（%）对照组 3 1.8±0.5槲皮素组 3 6.2±0.7*△γ δ T 细胞组 3 2 4.3±3.5*△槲皮素+γ δ T 细胞组 3 7 1.7±7.9槲皮素+γ δ T 细胞+M C L-1质粒组 3 2 9.5±3.8△

3 讨论

图3 槲皮素对Huh7细胞线粒体膜电位的影响

肝癌是世界上发病率最高的消化道恶性肿瘤之一，预后差，死亡率居所有恶性肿瘤的第3位[4]。在肝癌治疗中，尽管手术和肝移植治疗是目前最有效的治疗手段，然而对于不能进行手术的患者而言，免疫治疗是不可缺少的替代治疗手段[5]，而一些免疫效应细胞也已经开始作为药物进行临床试验，用于肿瘤治疗[6]。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，有较好的抗氧化和抗炎作用，近几年的研究表明槲皮素还有一定的抗肿瘤效应，能增强肿瘤细胞对凋亡信号通路的敏感性[7]。然而，槲皮素对肿瘤免疫治疗的协同作用至今无充分报道。本研究结果表明槲皮素能显著增强γδ T细胞对肝癌的细胞毒性，因此槲皮素可作为一种免疫治疗辅助药物。

MCL-1是属于Bcl-2蛋白家族的抗凋亡蛋白成员。研究表明人类肿瘤细胞中MCL-1往往会发生过表达，这可能是肿瘤细胞对不良环境的适应。通过辅助治疗降低肿瘤细胞中MCL-1的表达水平，可以有效抑制肿瘤细胞的生长增殖，并降低其对化疗药物的耐药性[8]，因此MCL-1可以作为肿瘤治疗的一个重要靶点。γδ T细胞现已被作为一种免疫治疗药物进行临床试验。这种T细胞亚群主要通过分泌一些凋亡诱导因子使肿瘤细胞发生凋亡。在γδ T细胞介导的凋亡信号通路中，其分泌的凋亡诱导因子能引起线粒体膜电位的下降，从而使细胞色素C等凋亡活性物质从线粒体中释放到细胞质中，导致caspase-9和caspase-3的活化，最终细胞凋亡[9-11]。

在本研究中，为了探讨槲皮素增强γδ T细胞抗肝癌活性的分子机制，进行了western blot实验。结果发现槲皮素能显著下调肝癌细胞中MCL-1这一抗凋亡蛋白的表达水平。当用重组真核过表达质粒上调肝癌细胞中MCL-1的蛋白水平后，槲皮素对γδ T细胞的协同抗肿瘤作用受到明显抑制，证明槲皮素是通过降低肝癌中MCL-1蛋白的表达促进γδ T细胞介导的线粒体途径的凋亡。

综上所述，本研究证明了槲皮素能有效提高γδ T细胞对肝癌的细胞毒性，增强γδ T细胞治疗效果，为肿瘤免疫治疗提供了更有效的策略和思路。

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