多杀性巴氏杆菌分型方法研究进展

祁 鑫，蒋桃珍，李伟杰

(1.北京农学院，北京 102206；2.中国兽医药品监察所，北京 100081)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)是一种人兽共患病病原菌，不但能够感染多种家禽、家畜和野生动物，而且可以感染人，主要引起呼吸系统疾病、局灶性感染及出血性败血症，导致的疾病包括禽霍乱、猪萎缩性鼻炎及肺炎、牛出血性败血症及肺炎、兔出血性败血症以及人的皮肤坏死等，严重威胁动物及人类健康[1]。不同型的多杀性巴氏杆菌与其导致的疾病存在一定的关联，因此开展多杀性巴氏杆菌流行病学调查，进行快速准确的分型显得尤为重要。

多杀性巴氏杆菌的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法，前者主要包括Carter分型和Heddleston分型[2-3]，后者主要包括荚膜多重PCR分型方法[4]、脂多糖多重PCR分型方法[5]、多位点序列分型方法(multilocus sequence typing，MLST)[6]、脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)[7]、全基因组测序(whole genome sequence，WGS)[8]等。本文就多杀性巴氏杆菌的分型方法研究进展进行综述，以期为临床多杀性巴氏杆菌流行病学调查提供参考。

1 血清学分型方法

多杀性巴氏杆菌的血清学分型方法包括基于间接血凝试验的Carter分型和基于琼脂扩散试验的Heddleston分型，分别依据荚膜抗原和脂多糖抗原的差异，前者分为A、B、D、E和F共5种血清群，后者分为1～16共16种血清型[9]。通常将两者结合起来表示多杀性巴氏杆菌的血清型，例如A∶1、B∶2等。多杀性巴氏杆菌的不同血清型与其所致的疫病有一定的关联，但不同血清型之间的交叉免疫保护较低，因此血清学分型方法的建立和应用对于流行病学的调查以及后续疫苗的研发具有重要的意义。但血清学分型方法基于细菌的表型特征，培养条件会影响这些表型特征的表达，从而降低鉴定的稳定性和可靠性，而且血清学方法操作繁琐，对抗血清的特异性有很高的要求，不适宜临床大规模快速进行流行病学调查。

2 基于荚膜编码区的多重PCR分型方法

针对Carter分型中不同血清群多杀性巴氏杆菌的全基因组序列分析发现，编码荚膜的基因成簇存在[10]，按照功能的不同分为3个区域，分别与荚膜多糖的输出、荚膜多糖的合成、荚膜多糖的磷脂替换有关，在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中，区域2存在一定的差异，其他2个区域较为保守[4]。血清群A、D和F荚膜多糖合成相关区域均含有4个编码基因(hyaE、D、C、B，dcbE、F、C、B，fcbE、D、C、B)，其中dcbF基因为血清D群菌株所特有，血清F群菌株的fcbD基因与血清A群菌株hyaD基因同源性为82%；血清群B和E均含有9个编码基因(bcbA、B、C、D、E、F、G、H、I，ecbA、B、J、K、D、E、F、G、I)，其中ecbJ基因为血清E群菌株独有，血清E群菌株的ecbD基因与血清B群菌株的bcbC基因同源性只有23%[4]。基于以上基因的不同位点，Townsend K M等[4]建立了多杀性巴氏杆菌荚膜分型的多重PCR方法。该方法具有操作简单、准确快速等特点，结果能够与Carter分型相对应，目前已完全取代Carter分型，在多杀性巴氏杆菌所引起的疾病的临床诊断中得到了广泛应用[11-12]。我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A群和D群，鸡群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A群。我国现行农业行业标准《禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术NY/T 563—2016》、《猪巴氏杆菌病诊断技术NY/T564—2016》也将此方法列入标准中。该方法存在的不足之处是部分菌株无法定型[13]。

3 基于脂多糖外核编码基因簇的多重PCR分型方法

多杀性巴氏杆菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)主要包括内核和外核两部分，内核由类脂A和核心低聚糖组成，外核由侧链低聚糖组成[14]。Harper M等[15]对Heddleston 1～16型多杀性巴氏杆菌参考菌株的LPS组装基因序列分析发现，这些菌株的LPS具有高度保守的内核和可变的外核。外核主要由不同数量的葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺以及庚糖等通过一系列的转移酶连接组成[14]。与LPS外核合成和组装相关的基因在多杀性巴氏杆菌基因组上分布较为集中，均位于两个保守的且与LPS合成无关的基因priA和fpg之间，不同的Heddleston血清型参考菌株包含有5～13个不等基因[14]。通过对其同源性分析，可将多杀性巴氏杆菌分为8个不同的基因型，LPS基因型L1包括血清型1和14，L2包括血清型2和5，L3包括血清型3和4，L4包括血清型6和7，L5包括血清型9，L6包括血清型10、11、12和15，L7包括血清型8和13，L8包括血清型16[5]。多杀性巴氏杆菌LPS外核编码基因簇的差异，为多杀性巴氏杆菌基于LPS分型提供了理论基础。Harper M等[5]根据不同Heddleston血清型外核侧链多糖组装所需的不同基因位点设计引物，建立了一种能对全部8种LPS基因型进行鉴定的多重PCR方法，该方法与质谱分析结果匹配良好，能够对全部16种Heddleston血清型的多杀性巴氏杆菌进行快速检测，但不能与Heddleston分型方法形成一一对应关系。Peng等从患呼吸系统疾病的猪肺脏分离获得115株多杀性巴氏杆菌，经LPS多重PCR分型检测包括2种基因型，其中L3 基因型占22.6%，L6基因型占77.4%[16]。

4 多位点序列分型方法

多杀性巴氏杆菌的多位点序列分型(MLST)是由多位点酶电泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)衍生而来的，是以核酸序列为基础对细菌进行分型的方法，它基于7个看家基因的等位基因位点的组合而获得目标菌株的序列型(sequence type，ST型)[6]。由于看家基因序列的变化速率很慢，若两菌株的分型结果相同，便可以认为这两株细菌属于相同克隆或克隆群。多杀性巴氏杆菌多位点序列分型在线数据库有2个(http://pubmlst.org/pmultocida)：RIRDC MLST由澳大利亚动物研究所开发，主要针对禽源多杀性巴氏杆菌[6]，所使用的7个看家基因为adk(腺苷酸环化酶)、est(酯酶基因)、pmi(6-磷酸-甘露糖异构酶基因)、gdhA(谷氨酸脱氢酶)、zwf(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、mdh(苹果酸脱氢酶)、pgi(磷酸葡萄糖异构酶)，目前共有344个ST型，但已停止对外服务；Multi-host MLST由英国格拉斯哥大学开发，针对不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌，所使用的7个看家基因为adk、aroA(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成基因)、deoD(嘌呤核苷酸磷酸化酶)、gdhA、g6pd(即zwf)、mdh、pgi，PCR扩增和测序引物参见http://pubmlst.org/pmultocida，目前共有72个ST型。多位点序列分型具有以下特点：分型力好、可重复性好；已经实现全球数据比对和综合分析；分辨力一般，不能单独用于暴发菌株溯源分析；成本比较高。已有研究表明，我国引起禽霍乱的禽源多杀性巴氏杆菌主要为ST129[14,16]。Petersen A等[17]和Moustafa A M等[18]分别对与出血性败血症相关的多杀性巴氏杆菌进行RIRDC MLST分析，发现与该病相关的菌株主要为ST122。García-Alvarez A等[19]对分离自不同商品化养兔场的11株多杀性巴氏杆菌进行multi-host MLST分型，发现全部为ST11。García-Alvarez 等对分离自绵羊肺炎的43株多杀性巴氏杆菌进行Multi-host MLST分型检测，共检测出16个ST型，其中ST50和ST19为主要的ST型，占全部菌株的53.5%，而且所有ST型只在患小反刍兽疫的羊中检测出，说明这些ST型所属菌株具有宿主特异性。研究还表明，绵羊分离株和猪分离株分属于不同的亚群[20]。上述研究均说明多杀性巴氏杆菌的ST型与动物疫病之间可能存在的一定的相关性。

5 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(PFGE)是基于细菌DNA指纹图谱的基因分型技术，基本过程是将纯培养的细菌与低熔点琼脂糖(含SDS)进行包埋，用蛋白酶K消化，待DNA释放后，选用识别稀有酶切位点的限制性内切酶切割基因组DNA，获得大小不等的DNA片段，在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，染胶、读胶，用计算机软件(如Bion Numeris)进行分析。影响脉冲场凝胶电泳分辨力的因素包括限制性内切酶的选择、脉冲时间、电场强度、温度、缓冲液组成、琼脂糖类型和浓度、电场夹角等。PFGE分型力好、分辨力高、可重复性好，已有成熟的标准化技术方案，可实现数据分析的网络化，对于大部分细菌是暴发溯源中细菌分型的“金标准”。Cardoso-Toset F等[21]对从不同患败血症猪的各种组织中分离的多杀性巴氏杆菌，利用Bsp1201限制性内切酶进行PFGE分型，证明为同一菌株感染。Moustafa A M等[18]对分离自巴基斯坦和泰国的23株多杀性巴氏杆菌进行PFGE分型发现，两国分离的菌株只有1条酶切条带的差异，而且各国田间分离株与各自使用的疫苗株带型相同。Dagleish M P等[22]对英国临床分离的1株牛源多杀性巴氏杆菌与美国1株牛肺炎模型菌株进行比较分析，PFGE分别有10条和11条带，说明两者之间具有地域和遗传学上的差异，而且气管内接种两者引起的病理严重程度不同，这也对新型疫苗的研发提供了依据。

6 全基因组测序

全基因组测序(WGS)是指通过高通量测序技术对病原菌整个基因组进行测序，并通过生物信息学技术对序列特征进行分析，可在全基因组水平探究物种的遗传进化规律和种群迁移等。目前，全基因组测序分型主要有两种方式，即基于全基因组的单核苷酸多态性分型(whole genome-based single-nucleotide polymorphisms,wgSNP)和基于全基因组的多位点序列分型(whole genome multilocus sequence typing,wgMLST)。wgSNP是在全基因组序列的水平上选择一定数目的SNP，比较不同细菌基因组SNP的信息，从而达到将同一个种内的不同菌株进行分型的目的。wgMLST是使用某一个种的细菌核心基因组中的成百上千个基因位点的序列差异对菌株进行区分和分型的方法。Moustafa A M等[8]对12株引起败血性出血症的多杀性巴氏杆菌和1株疫苗株的全基因组序列测序后，基于wgSNP构建系统发育树，发现分离自不同国家的菌株聚类在不同的分支；比对1 824个核心基因后发现，96个基因为13个菌株所共有，全基因组测序一方面能对上述菌株进行区分，另一方面也能提供候选基因用来建立快速诊断技术。全基因组测序方法在多杀性巴氏杆菌分型中由于在全基因组水平基于序列多态性进行分型，因此理论上比传统的分子分型方法具有更高的分辨力，具有良好的分型力、可重复性和实验室间可比性，便以建立分析网站和公共数据库，容易实现标准化和网络化应用，具有取代目前所有分子分型方法的潜力。

7 小结和展望

多杀性巴氏杆菌的血清分型或基因分型是其流行病学调查常采用的方法，选择适宜的分型方法，对于了解其感染和致病规律等具有十分重要的意义。理想的病原菌分型方法应具备以下几点：一是分型力好，能获得菌株分型结果；二是分辨力高，能够区分不相关的菌株；三是可重复性好，对同一菌株反复测试能够获得相同的结果；四是可比性好，不同实验室的结果可以放在一起分析。基于以上几点，采用标准化的细菌分子分型监测技术，构建细菌性传染病分子分型实验室监测网络，发现特征型别簇，提出预警信息，通过流行病学调查，发现细菌性传染病暴发流行，尤其是发现传染病跨地区传播和散在分布于不同地理区域的暴发流行，有助于实现细菌病监控、跨地区关联分析和传染病的溯源。尤其是随着测序技术的成熟，全基因组测序所需时间和成本不断降低，为在全基因组序列水平上进行流行病学分析提供了基础。WGS分型因其全面反应了病原菌的遗传和变异特征，提高了菌株进化和溯源分析的分辨力，有助于快速确认并追踪病原体、描述菌群结构、评估某种致病菌群的出现和传播机制，其结果不但可以直接与经典微生物分型方法，如MLST和PFGE进行比对，同时还可以通过公共数据库方便全球共享和分析，在疾病监控和暴发调查中将发挥越来越大的优势作用。