单纯疱疹病毒感染过程中的免疫应答

2018-04-17李凌浩李林杰常秋燕郭富城王悦萦马忠仁马晓霞

动物医学进展 2018年8期

李凌浩，马鹏，李林杰,，常秋燕，郭富城，王悦萦,马忠仁，李倬，马晓霞

(西北民族大学生命科学与工程学院/西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030)

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)属于疱疹病毒科α病毒亚科，是一种DNA病毒。HSV具有神经细胞嗜性，可以潜伏在神经细胞中，处于潜伏感染。 HSV感染是宿主免疫应答抵抗HSV感染靶细胞的结果，这导致HSV复制活动的中止以及相关病毒基因表达的沉默。虽然目前一些利用特异性抗体来进行HSV感染病例的临床治疗在试验尝试阶段[1]，但是宿主免疫反应是如何导致HSV从复制阶段转变为潜伏阶段的还有很多尚未明确的疑点，似乎HSV的潜伏-复制阶段的切换是处于一种动态平衡中[2-4]。携带HSV-1和HSV-2的患者一般是经过口腔或者生殖道存在的病毒进行传染的，在这种状态下无任何临床表现[5-7]。但是最新研究表明，当一种乳酸杆菌 (Lactobacilluscrispatus)吸附在哺乳动物细胞表面时，可以有效干扰HSV对靶细胞的侵染[8]。当HSV进入一个新的易感环境中，HSV首先在上皮细胞内复制(特别是在口和生殖道)，1 d～3 d内，HSV可在上皮细胞内进行100倍～10 000倍的增殖，然后传播到神经末梢。一旦HSV感染神经末梢，在受神经支配的神经节内，通过逆转运方式将核衣壳从轴突运送到神经细胞体几厘米远的地方[9]。感染期达到3周后，HSV复制活性将会显著减弱，此阶段被称为潜伏感染。神经元是HSV潜伏感染的存储器，神经元独特的细胞生物学特点是HSV建立潜伏感染的物质基础[10]。多种神经特异性调制因子(诸如Oct-2、Zhangfei和CoREST)是调节HSV感染从复制期进入潜伏期的一些物质基础[11-14]，此外，HSV在神经元细胞中的复制相对于在上皮细胞中复制是相当困难的。如果上皮细胞和神经元对HSV复制上存在本质的嗜性差别，这些差别本应该反映了感染性HSV的数量，但是在HSV初级感染过程中，病毒数量取决于上皮细胞与其受支配的神经节比值。HSV-1的复制活动主要发生在三叉神经的神经元中[15]。但是毋庸置疑，宿主细胞中的一些蛋白因子在DNA病毒复制的过程中发挥着重要作用[16]。

1 天然免疫在HSV感染中的作用

在神经细胞内，CD8+T细胞与HSV感染的建立存在直接的相互关系。特别是在神经节细胞内，CD8+T细胞对神经节细胞的浸润可能是导致HSV复制停止的重要因素。此外，当HSV感染传播未经过外周神经系统时，CD8+T细胞不能被及时招募到神经节，病毒会对神经元细胞进行快速且大规模的破坏。进一步研究表明，HSV复制的T细胞依赖性抑制不受神经元细胞生理状态的影响，并且T细胞在HSV感染早期可以高效对其病毒相关抗原进行清除[17]。此外，自噬也是抗击DAN病毒最有效的一种防御手段，这是通过HSV诱导细胞SUN结构域蛋白家族成员 (tripartite motif,TRIM)来实现的，这有助于避免HSV感染破坏组织后机体产生炎症反应加深对机体组织的破坏程度。最近，科研人员针对HSV-2 的特异性CD8+T细胞开展了效应因子CCR10与CXCR3的选择性表达，并且在抗击HSV-2侵染的过程中取得了很好的效果[18]，这也为降低由于HSV感染对机体组织损伤带来了新的途径。

HSV感染并破坏上皮细胞后，上皮组织完整性遭到破坏，机体将自动开启自愈模式。自愈前期是通过急性炎症细胞如多形核白细胞(polymorphonuclear leucoytes,PMNs)和长效专职抗原递呈细胞(long-lived professional antigen presenting cells,APCs)来清除细胞碎片。在吞噬死亡细胞的过程中，PMNs和APCs分泌一系列的化学趋化因子和细胞因子，这些因子加速了炎症过程，从而导致毛细血管通透性降低，促进免疫介质从脉管系统移出进入到组织损害位点[19-21]。当专职性抗原递呈细胞 (MHC Ⅱ类分子阳性细胞) 游走到受损组织周围时会将病原的抗原肽进行递呈，并且富集抗原肽，而后携带所递呈特定抗原肽的APC回流到附近淋巴结后，将抗原肽递呈给T和B淋巴细胞[22-23]。在这个感染和修复过程中，促炎性细胞因子如白介素1 (interleukin 1，IL-1) 和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)以及趋化因子，如CXCR-3、 CXCL-10和IL-8，使白细胞通过血流进入病毒复制灶点和组织损害位点来清除受损组织细胞[24-26]。HSV的糖蛋白M在病毒侵染细胞形成合胞体的过程中发挥着重要作用，这一机制也为研究天然免疫抗击HSV侵染提供了新的思路[27]。

干扰素(interfron，IFN)除了具有抗病毒作用外，在免疫调节方面也发挥重要作用。IFN促进CD4+T细胞增殖，促进细胞介导的免疫反应。另外，IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加(10倍～20倍地增加),增强其抗原递呈能力，这增强了抗体的抗病毒免疫反应，MHCⅡ类分子肽结合槽的两端呈开放状，能容纳10个～30个氨基酸残基的肽段，递呈给CD4+T细胞。CD4+T细胞依次促进CD8+T细胞和B细胞的增殖和分化。在IFN拮抗HSV侵染的过程中，NF-κB和p65蛋白介导的免疫信号通路是调节相关免疫反应的重要调节路径[28]。

2 适应性免疫在HSV感染中的作用

2.1 B淋巴细胞的作用

当HSV侵染机体初期， IgM会快速的由B淋巴细胞爆发式产生，产生IgM是产生其他抗体同型体的初级阶段，细胞因子和B细胞受体重链基因遗传重排引起的抗体类别转换会产生其他类型的抗体。抗体的类别转换涉及了编码IgM重链外显子的缺失，这个缺失使B细胞选择性地应用编码IgA、IgE或IgG重链的3链外显子，这样在HSV感染初期，特异性IgM抗体在血清中3 d～5 d就能检测出来，而HSV特异性IgG抗体开始累积，至少需要7 d的时间。HSV特异性IgM抗体是HSV初级感染的确诊标志。在宿主抵抗HSV感染的防御过程中，HSV特异性IgM抗体并不发挥主要的功能，因为IgM不能扩散到病毒感染的组织中。由于IgM抗体的半衰期较短，通过特异性分化成长效的记忆淋巴细胞，这就出现了当IgM滴度下降的时候，特异性IgG的滴度会迅速上升。HSV特异性IgG可降低HSV感染的发生和传播，但是不足以抑制疱疹病毒感染的复发，HSV感染无症状携带者在其生命周期中维持很高的HSV特异性的IgG抗体水平，因此在整个时期维持着HSV特异性的IgG抗体水平。

2.2 T淋巴细胞的作用

习惯上将CD4+T细胞称为“辅助性T细胞”，是因为它能帮助和促进抗体反应和对外源抗原的细胞免疫反应。用HSV-2疫苗进行肌肉注射，IL-17可以激活Ⅰ型辅助性T细胞在免疫调节方面的作用[29]。激活HSV感染过程中，HSV特异性的CD4+T细胞可促进抗体的类别转换，并促进随后的HSV特异性B细胞分化为长期记忆细胞。同样，HSV特异性CD4+T细胞促进HSV特异性CD8+T淋巴细胞的克隆扩增，分化成各种免疫效应细胞，从而破坏HSV感染细胞以及分泌阻止HSV复制的各种细胞因子。CD8+T细胞被称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTLs)，可杀死病毒感染的靶细胞。CD8+T细胞也可能通过分泌IFN-γ来控制病毒感染，干扰病毒复制，但并不危害宿主细胞的正常活性。

3 干扰素在HSV感染中的作用

几乎所有哺乳动物细胞均可产生不同水平的IFN，作为抗击病原体侵染机体的重要防线。产生IFN-α的白细胞似乎是IFN-α/β的主要来源，它可在活体内限制HSV的传播[30-31]。在眼角膜上皮细胞中存在的E3泛素化连接酶三基序蛋白32(E3 ubiquitin ligase tripartite motif protein 32)可以正调控HSV诱导产生的IFN-β含量，从而抗击HSV的侵染[32]。对于IFN-γ而言，状态就更为复杂，在宿主抵抗HSV的免疫反应中，IFN-γ发挥的作用受到T细胞的生物学性状和适应性免疫反应的动力的影响。活化的CD8+T细胞分泌的IFN-γ作为与感染病毒的细胞接触为信号，通过与展示出8～10氨基酸病毒多肽于细胞表面的MHCⅠ分子与T细胞抗原受体结合启动初级免疫应答。在初次感染HSV的个体中，形成特异性抗击HSV侵染的T细胞的几率非常低(1/100 000)。直到感染5 d ～8 d后，HSV特异性CD8+T细胞才有助于宿主控制HSV感染。特异性识别HSV的CD8+T细胞连续进入淋巴结，将在其中扩殖。HSV特异性CD8+T细胞的数目从10倍增加到300倍，从而产生强大的免疫压力促使HSV感染进入潜伏期。

CD8+T细胞可能控制了HSV在神经元的复制，其原因可能是由于CD8+T细胞分泌合成IFN-γ抑制HSV的深入侵染。直接的证据为当T细胞浸润HSV感染的神经节时，HSV会在神经元细胞中停止复制。在多项研究中均可观察到CD8+T细胞与神经元发生直接接触，但神经元在外观上仍保持健康状态，这表明CD8+T细胞依赖非溶细胞机制控制HSV在神经元的复制。令人惊讶的是在急性感染消退后，活化的CD8+T细胞仍可在HSV感染的神经节内存留数月之久。在HSV潜伏感染部位，CD8+T细胞持续分泌IFN-γ的现象,可能说明HSV仍然在潜伏感染部位低量复制，从而维持了针对HSV特异性的CD8+T细胞的免疫学活性。但是HSV-1针对CD8+T细胞侵染是由于病毒蛋白VP11/12通过磷酸化途径将细胞蛋白Dok-2降解后发生的[33]，将会促进患者病毒性脑炎的形成[34]。虽然IFN-α/β和IFN-γ信号通路介导的受体彼此具有高度的独立性，但是当IFN-α/β和IFN-γ受体能够以1∶1的比例混合时，可以发生免疫共沉淀。IFN-α/β受体和IFN-γ受体的共激活能够抑制HSV在培养细胞中的复制。这是因为HSV侵染激活IFN系统后，天然免疫与适应性免疫实现互作，一些IFN-γ小分子配体结合到IFN-γ受体上，便可直接提高IFN-α/β的抗病毒作用。在抵抗HSV侵染过程中，Ⅲ型IFN所发挥的显著抗病毒作用是不可忽视的，而Ⅲ型IFN针对HSV的抗病毒作用是由调节子23复合物 (mediator complex 23)与干扰素刺激转录因子7 (interferon-responsive transcription factor 7)的互作实现的[35]。

4 HSV毒力相关蛋白在免疫反应中的作用

HSV可以产生一种神经毒力因子，该因子是由病毒基因组中RL1基因编码的，后来又被称为ICP34.5基因。ICP34.5蛋白能与细胞蛋白磷酸酶1发生相互作用,并刺激真核翻译起始因子eIF-2α磷酸化，从而阻止细胞中相关蛋白的合成。在体外培养试验中，RL1基因的缺失很容易导致缺失株自带病毒复制的停止，容易使HSV在神经元中建立潜伏感染。事实上，缺失ICP34.5的HSV很容易在神经元建立潜伏感染，高剂量的ICP34.5缺失毒株可被注入到患者的脑肿瘤中用作后期治疗的手段。由于缺失ICP34.5的HSV不能在健康人的神经元中进行复制，因此在不损伤脑胶质瘤患者的健康脑组织的情况下这些溶瘤病毒可以选择性的破坏癌细胞。HSV产生的ICP0和ICP34.5毒力蛋白可抵抗体外干扰素的抗病毒作用。HSV对IFN-α/β的拮抗过程是一个病毒自身活化的过程，主要依赖于ICP0和ICP34.5毒力因子的合成。其中，ICP34.5蛋白通过控制干扰素调节因子3 (interferon regulator factor 3)来抑制IFN的生成，并且刺激可以拮抗IFN的相关蛋白因子的合成[36]。野生型HSV在未经IFN-α/β处理细胞上的复制率是被IFN-α/β处理后的细胞中的复制率的3倍。与此相反，缺失ICP0编码基因的HSV缺失株在未经处理的细胞上的复制率是在IFN-α/β激活细胞上复制率的300倍。同样，缺失ICP34.5编码基因的HSV缺失株也表现出相似的IFN-敏感性表型。重要的是，当突变HSV 30个辅助基因中的其中任何一个，干扰素敏感型都成为非特异性表型；在培养细胞中，在VP16、ICP22、UL7、UL13和VHS基因上的突变均不会影响HSV抵抗IFN-α/β诱导的阻遏[37]。而HSV含有的Us2基因的表达产物是可以靶向TAK1调节因子来控制NF-κB介导的信号通路，从而影响IFN的产生[38]。