葡萄球菌和微球菌对广式腊肠风味的影响

郑培君，程海涛，齐明

(1.佛山职业技术学院，广东 佛山　528137；2.广丰区农业局，江西 上饶　334600)

广式腊肠是岭南地区传统风味特色食品，因其咸中带甜、酒香醇厚的独特风味深受广大消费者喜爱。龙卓珊等利用固相微萃取结合嗅觉检测法鉴定出13种广式腊肠特征风味化合物，包括4种醛、8种酯和1种酮[1]。Du M和Ahn D U利用顶空气质联用方法测定其风味物质成分主要有醇类、酯类、醛类和酮类物质，还有部分烃类和环类化合物[2]。这些风味物质主要来源于辅料、非微生物直接参与的生化反应(包括糖降解、蛋白质水解、脂肪氧化、 Strecker降解、Maillard反应等)以及微生物酶降解脂类、蛋白质和碳水化合物形成的风味物质。其中微生物对风味物质成分形成的重要作用早就被人们意识到，直达近十多年来，关于发酵剂对产品风味物质成分的影响才有更深入的研究[3-5]。Berdagué在1993年首先提出，葡萄球菌对于干香肠芳香气味的形成具有优势作用[6]。微球菌和葡萄球菌在发酵和成熟过程中能够产生降解蛋白质和脂肪的酶，酶解的产物在干发酵香肠特征风味形成中起了重要作用[7]。Montel等研究也发现，葡萄球菌属的微生物和肉中自身脂酶共同作用，参与了脂肪的降解过程，对香肠中脂肪酸的释放产生了一定的影响，大量的脂肪酸释放出来，进一步转化形成了甲基酮和醛，为肉制品提供了独特的风味[8]。本研究将分离自腊肠中的葡萄球菌和微球菌用于广式腊肠的发酵生产，接种量为106cfu/g，采用固相微萃取与气质联用的方法对腊肠中的风味物质成分进行测定，分析接种分离菌株对广式腊肠风味的影响。

1　材料

1.1　菌种

使用菌株均由本研究室分离并保藏，葡萄球菌编号为H33B，微球菌编号为X142B。

1.2　材料与试剂

猪后臀肉、猪背膘、白砂糖、盐、白酒、鸡精、味精，均购于当地超市；试验中所用试剂，均为国产分析纯试剂。

1.3　仪器与设备

SZ-22A型绞肉机、ZX-5L型手摇灌肠机广州旭众食品机械有限公司；101-3A型数显电热鼓风干燥箱上海雷韵试验仪器制造有限公司； ZHJH-1112超净工作台、SPX-450生化培养箱上海新苗医疗器械制造公司；YX-280高压灭菌锅合肥华泰医疗设备有限公司；QYC-2102C摇床上海福玛实验设备有限公司；Trace-MS气相色谱-质谱联用仪美国Finnigan公司；65 μm DVB-PDMS萃取头美国Supelco公司。

2　方法

2.1　菌株的活化和接种数量的确定

将保藏菌株吸取50 μL的原菌液接入到含MSA液体培养基中活化2次测OD值。然后根据稀释平板法事先做好每株菌种的OD值和其活菌落总数的曲线关系图和曲线方程，算出的OD值所对应的菌落总数。最后，菌体的浓度用无菌水调节至所需的浓度，待用[9]。

2.2　广式腊肠加工工艺

2.2.1腊肠配方

肥肉和瘦肉之比为3∶7，背脂切成0.6 cm×0.6 cm小丁，其他辅料按肉的质量添加，食盐2%，糖13%，酒2%，亚硝酸钠0.15%，水20%。菌株的接种量为106cfu/g。

2.2.2烘烤参数

分为3个阶段：0～12 h 55 ℃(降温通风8 h)； 50 ℃ 16 h(降温通风8 h)；45 ℃ 24 h。

2.2.3对照组

仅添加150 mg/kg的亚硝酸盐，不添加微生物。

2.2.4H+X组

添加106cfu/g的葡萄球菌H33B和微球菌X142B(1∶1)及150 mg/kg的亚硝酸盐。

2.3　风味成分的分析

2.3.1顶空固相微萃取(HS-SPME)法

固相微萃取头的老化：65 μm DVB-PDMS萃取头在气相色谱进样口220 ℃老化4 h。

采用HS-SPME法对广式腊肠挥发性成分的萃取。方法如下：腊肠样品用小型食品搅拌机绞碎均匀后，迅速取60 g置于20 mL萃取瓶中，萃取头插入萃取瓶并推出吸附纤维头(不能接触样品)，60 ℃恒温吸附30 min，然后缩回纤维头，将针管退出样品瓶，随后插入气相色谱仪进样口220 ℃解吸3 min。

2.3.2色谱条件

利用气/质(GC/MS)联用仪(Trace GC/MS，Finnigan)进行风味成分分析。气相色谱条件为：毛细管柱：DB-1柱(30 m×0.32 mm；液膜厚度1 μm)；柱温升温程序：起始温度45 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min的升温速率升温到80 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的升温速率升温到180 ℃，保持4 min；汽化室温度为220 ℃，载气为He，流速为1.0 mL/min，进样方式：按分流比10∶1进样。

2.3.3质谱条件

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV，灯丝发射电流200 μA，检测器电压为350 V，离子源温度200 ℃，接口温度220 ℃，扫描质量范围35～395 amu。

2.3.4风味成分的鉴定

实验数据处理由Xcalibur软件完成，未知化合物经计算机检索的同时与NIST谱库(107000个化合物的数据)和Wiley谱库(320000个化合物的数据，Version 6.0)相匹配，只有当正反匹配度均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以确认。同时利用Willey和NIST谱图库工作站数据处理系统按峰面积归一化法进行定量分析，求得各化学成分在广式腊肠挥发性风味物质中的相对百分含量。

3　结果与讨论

本试验中我们采用顶空固相微萃取的方法提取腊肠中的风味物质成分，然后利用气质联用仪对风味物质成分进行定性和定量分析，考虑到试验的可行性我们只对腊肠成品的风味进行了分析。对照组广式腊肠的GC/MS图谱见图1，H+X组广式腊肠的GC/MS图谱见图2。

图1　对照组广式腊肠的GC/MS图谱Fig.1 GC/MS chromatogram of control group of cantonese sausage

图2　H+X组广式腊肠的GC/MS图谱Fig.2 GC/MS chromatogram of H+X group of cantonese sausage

所筛选微生物对风味的影响见表1和表2。

表2　接种菌种对广式腊肠挥发性风味物质的影响Table 2 Effects of inoculation of two strains on the flavor compounds in cantonese sausage

续　表

续　表

由表1可知，所筛选菌株对广式腊肠的挥发性风味物质有一定的影响，H+X组分离鉴定出广式腊肠挥发性风味物质56种，比对照组多了18种。其中从对照组鉴定出3种醇类(42.22%)、14种酯类(31.81%)、10种醛类(22.19%)、8种烷烯烃及含氧衍生物类(2.91%)、1种芳香族及其衍生物类(0.66%)。从H+X组鉴定出5种醇类(7.69%)、21种酯类(76.96%)、10种醛类(9.76%)、5种酸类(1.97%)、2种酮类(0.12%)、5种烷烯烃及含氧衍生物类(0.62%)、5种芳香族及其衍生物类(1.65%)。结果表明接种葡萄球菌和微球菌可以产生更多种的酯类、醇类、醛类和酮类物质，显著提高了酯类物质的含量。

3.1　接种分离菌对醇类物质的影响

在醇类物质中以乙醇(ethanol)的含量最高，不同处理组的乙醇(ethanol)含量各有不同，例如对照组腊肠的乙醇占其总挥发性物质的42.22%，而H+X腊肠只有其总挥发性成分的7.69%，除乙醇外(ethanol)，1-辛烯-3-醇(1-okten-3-ol)是两组腊肠中共有的醇类物质，而异戊醇(3-Methyl-1-butanol)、2-硝基乙醇(2-nitro-Ethanol)、正庚醇(n-heptanol)、正辛醇(1-Octanol)只能在个别的腊肠中检测出来。醇类有清香、木香、脂肪香等香气特征[10]，而且沸点低、挥发性好，可能对腊肠表香有一定的贡献。另外醇类物质跟酸类物质结合生成酯类物质，对腊肠部分酯类物质的形成提供条件。许鹏丽[11]研究发现优级腊肠挥发物质中乙醇占总挥发物的62.18%，一级腊肠的挥发物中乙醇占64.03%。广式腊肠加工过程会加入2%(质量比)的白酒，Sun等[12]也认为酯类和醇类是广式腊肠的主要风味物质。

3.2　接种分离菌株对酯类物质的影响

在所检测酯类物质中，不同处理组腊肠酯类物质种类和含量差别很大。对照组的酯类物质主要以辛酸乙酯(Ethyl caprylate)和葵酸乙酯(Ethyl caprate)为主，分别占其总挥发性物质的11.01%和8.51%；H+X组腊肠的酯类物质主要以乙酸乙酯(Heptanoic acid, ethyl ester)和异戊酸乙酯(Ethyl isovalerate)为主，分别占总挥发性物质的35.31%和18.56%。辛酸乙酯有类似白兰地的香气，并有甜味；乙酸乙酯有甜果香，微带果香的酒香；异戊酸乙酯有水果、葡萄酒、苹果的气味。结果表明分离菌株可以提高腊肠中酯类物质含量。酯类物质对于腊肠的特征性风味起重要的作用，可赋予腊肠果香和花香风味，由长链脂肪酸所形成的酯则会产生一种具有酯香特征的风味[13]。腊肠中的酯类挥发性成分主要是乙酯类化合物，它们主要是来自于微生物的酯化作用。腊肠成熟过程中糖发酵、脂肪水解和氨基酸的氧化作用产生的酸与醇之间发生酯化生成酯类物质[14]。

3.3　接种分离菌对醛类物质的影响

由表1可知，醛类物质在对照组中含量为 22.19%，H+X组中含9.76%，低于对照组。己醛(Hexanal)、庚醛(Heptanal)、2-庚烯醛(2-Heptenal)、辛醛(Octanal)和E-2-辛烯醛((E)-2-Octenal)、壬醛(1-Nonanal)、十六烷醛(Hexadecanal)是两组腊肠中共有的醛类物质，其他5种物质只在个别产品中检测到。鉴定出的醛类物质主要是直链的 5～9 个碳原子的醛类物质，Berdagué等人曾报道4～10个碳原子的直链醛是肉制品中对风味有着重要贡献的醛。两组中都是己醛和壬醛的含量最高，己醛是亚油酸氧化的产物，一定程度上代表着脂肪氧化的程度。所鉴定出的醛类物质主要是中等相对分子质量的醛类和较高的相对分子质量的醛类，主要赋予的风味是清香、奶油香、脂香和橘子皮香[15]，这些醛类也许对广式腊肠的风味具有较大的贡献。

3.4　接种菌株对酸类物质的影响

酸类物质在广式腊肠中检出种类很少，一共有5种，只在H+X组检出，H+X组还含有0.18%的L-乳酸，这是由于接种微生物发酵产生的。这也说明酸类物质不是广式腊肠的特征性风味物质。这也是广式腊肠跟西式发酵肠不同的地方，西式发酵肠pH值较低，酸味较重。酸类物质能跟醇类结合生成酯类物质，对酯类物质的生成有一定的贡献。

3.5　接种菌株对酮类物质的影响

酮类物质只在H+X组腊肠中检出且含量仅为0.12%。多数的酮具有清香的气味、或奶油味或果香味，由于酮类物质在广式腊肠中的含量普遍较低，对风味贡献不大。

3.6　接种菌株对其他挥发性物质的影响

烷烯烃类及含氧化合物在广式腊肠中所占的比例一般在0.4%～2.91%范围内，正十五烷(Pentadecane)、十六烷(Hexadecane)这两种烃是两组腊肠中共有的烃类物质。广式腊肠中所检测的烷烃类物质的碳链都比较长，主要是C13～C22。烯烃类物质在广式腊肠检出也极少。由于烃类物质的风味阈值比较高，对广式腊肠的风味贡献很小[16]。

芳香族类化合物在广式腊肠中存在比较多的有苯乙醛(Phenylacetaldehyde)、苯甲酸乙酯(Ethyl benzoate)、苯乙醇(Phenethyl alcohol)和苯乙酸乙酯(Ethyl phenylacetate)，其他类的芳香族化合物只在个别腊肠中存在。芳香族化合物在广式腊肠中含量在0.26%～1.65%之间，这也说明芳香族类化合物对广式腊肠中的风味贡献也不大。芳香族化合物并不是来自肉制品本身，有可能来源于外界的污染，比如洗涤剂之类的污染，也有可能来自于腊肠包装物中高分子物质的迁移[17]。

含氮类、含硫类、呋喃类、酰胺类等其他化合物在广式腊肠中含量极少，固相静态微萃取很难萃取到，所以检测不出来。

4　结论

酯类物质是广式腊肠风味中的特征性物质，酯类物质一般具有清甜而成熟的果香，同时还具有酒香的底韵，能掩盖腊肠中肉的腥味，对腊肠的头香有比较大的贡献，给人一种非常愉快的酯香味，对腊肠的风味贡献非常大。其次是醇类物质，这主要跟广式腊肠制作时添加了酒有关。再次是醛类物质烷烯烃及其含氧衍生物类物质、芳香族类化合物和酮类物质，酸类和含硫类等其他类化合物含量和种类都极少。H+X组丰富了醇类、醛类和酮类物质，显著提高酯类物质的种类和含量，改善了广式腊肠的风味。接种组具有较好的风味是由于添加菌种后，在微生物酶和内源酶的作用下发生蛋白部分降解、脂肪降解和氧化，生成了更多的风味物质[18]。

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