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山河陈醋生产中酵母菌产酒产酯特性研究

2018-04-17郑树炀曹彦军吕玉柱郝林

中国调味品 2018年4期
关键词:大曲食醋酒精度

郑树炀,曹彦军,吕玉柱,郝林*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院,山西 太谷 030801;2.山河醋业股份有限公司,山西 和顺 032700)

山河醋业有限公司位于山西省晋中市和顺县阳光占乡阳光占村,其前身为和顺县阳光醋厂。阳光醋厂成立于1978年,是在有几百年酿醋历史的“德盛昌”醋坊的基础上成立的乡镇企业。阳光醋厂出色地传承和发展了和顺醋的传统酿造工艺和技能,在20世纪80年代初期,阳光醋厂的产品销往全国的多个省市,与“水塔”齐名,成为山西老陈醋的代表类产品,后来企业发展缓慢,但仍然坚持将山西老陈醋的传统制作工艺传承了下来。

大曲质量是决定陈醋品质的内在因素[1]。大曲中微生物种类十分复杂,主要包括细菌、霉菌、酵母菌和放线菌[2,3]。由于菌种多,在酿造过程中生成不同的香气成分,构成独特的风味[4]。大曲依靠自然接种,在很大程度上受环境因素的制约[5],酒化力低,导致产醋率不高。其中酵母菌是老陈醋生产过程中的功能性微生物之一,除了生成醇之外,还代谢生成醛、酸、酮、酯等香气成分,这些物质对食醋的风味品质起着重要的作用[6-8]。从山河陈醋大曲中分离酵母菌,并研究酵母菌特性、产酒能力,可为提高大曲质量提供依据,从而提高醋的品质和生产效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大曲、封罐前的酒醪:山河醋业有限公司;高粱:市售;无水乙醇、硝酸钾、硝酸钠、氢氧化钠、浓硫酸等试剂:均为国产分析纯;淀粉酶(20000 U/g):山东龙元生物工程有限公司;糖化酶(50000 U/g):湖南新鸿鹰生物工程有限公司。

YEPD液体培养基:酵母膏1 g,蛋白胨2 g,葡萄糖2 g,蒸馏水100 mL。YEPD固体培养基:酵母膏1 g,蛋白胨2 g,葡萄糖2 g,琼脂2 g,蒸馏水100 mL。发酵培养基:酵母膏1 g,蛋白胨2 g,葡萄糖20 g,蒸馏水100 mL。豆芽汁培养基:黄豆芽125 g,蒸馏水1000 mL,煮沸0.5 h,过滤取汁。无氮合成培养基:葡萄糖2 g,磷酸二氢钾0.15 g,七水硫酸镁0.05 g,酵母膏0.02 g,琼脂2 g,蒸馏水100 mL。同化氮源基础培养基:葡萄糖2 g,磷酸二氢钾0.15 g,七水硫酸镁0.05 g,酵母膏0.02 g,琼脂2 g,氮源2 g,蒸馏水100 mL。醋酸钠琼脂固体培养基:葡萄糖0.1 g,氯化钠0.18 g,酵母膏0.25 g,醋酸钠0.82 g,琼脂2 g,蒸馏水100 mL。以上培养基均经过115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

PR-CJT-4超净工作台上海普瑞斯仪器有限公司;YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂;GNP-9160电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司;722G可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;Trace ISO气相色谱-质谱联用仪Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1酵母菌株的分离

分别取25 g大曲、酒醪放入装有225 mL无菌水中振荡10 min,静置30 min,取上清液1 mL装入盛有9 mL无菌水的试管中进行梯度逐级稀释,做成10-2~10-7的溶液,吸取各梯度溶液0.2 mL于YEPD固体培养基上涂布均匀,置于30 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h。挑取光滑、湿润、粘稠的优势菌落,进一步划线分离纯化后,保藏备用[9-12]。

1.3.2菌株形态鉴定

菌落形态:将菌种接到YEPD固体培养基,于30 ℃恒温培养箱培养48 h,观察菌落表面、形状、颜色、边缘、隆起程度、繁殖方式等。

细胞形态:挑取单菌落均匀涂载玻片上,于高倍镜下观察,记录菌体形状、繁殖方式。

假菌丝形态:将生长旺盛的菌种接到YEPD固体培养基,于30 ℃恒温培养箱培养7天,观察是否有菌丝长出,并在高倍显微镜下观察菌丝形态。

子囊孢子:将生长旺盛的菌种接到醋酸钠琼脂固体培养基,于30 ℃恒温培养箱培养7天,挑取单菌落于载玻片上进行简单染色后在油镜下进行观察。

1.3.3生理生化鉴定

糖发酵实验:用无菌水将测试糖配成10%的溶液,吸取一定量的糖液分装于含有杜氏管的豆芽汁试管中,使糖浓度达到2%。将新鲜菌种接入含有不同糖类的豆芽汁试管中,30 ℃培养,每天观察结果[13],实验用的糖类有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉。

氮源同化实验:将测试菌株接种于无氮合成培养基中,于30 ℃饥饿培养7天。然后接入含有不同氮源的同化氮源基础培养基的平板中,混匀后静置,待凝固后置于30 ℃培养3天,观察并记录结果,阳性反应者在培养皿中有酵母菌生长[14],实验用的氮源有硝酸钾、硝酸钠。

1.3.4酵母菌的生产性能测定

耐酒精性能:分别取0.2 mL菌悬液接种到10 mL酒精度分别为9%,11%,13%,15%,17%的YEPD液体培养基的试管中,混匀后在30 ℃培养1天,以灭菌YEPD液体培养基为对照,用分光光度计测量OD600 nm值,并记录。

产酒、产酯性能:挑取单菌落制备菌悬液,以10%的接种量接种至盛有100 mL发酵培养基的三角瓶中,用8层纱布封口,培养基培养24 h后用塑料薄膜封口。由于塑料薄膜有一定的透气性,每24 h称重1次,测定CO2失重量,并记录。2次称重差值小于0.5 g时视为发酵结束。测定发酵液的酒精度及总酯含量。

酒精度:按照GB/T 10345-2007的蒸馏法。总酯:碱液皂化法[15]。

1.3.5挥发性成分的测定

1.3.5.1发酵液的制备

将高粱粉碎,用65%的水分浸泡4 h,加入3倍的水煮沸1 h,在90 ℃下加入3%的淀粉酶,水浴直至淀粉全部酶解,待温度降至60 ℃下再加入0.5%的糖化酶酶解1 h,按10%的接种量接入酵母菌,有氧培养24 h后保鲜膜封口,无氧发酵7天,采用GC-MS测定挥发性成分[16-21]。

1.3.5.2气相色谱条件

TG-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),不分流,氦气(He)流速:1 mL/min;进样口温度:250 ℃,解吸10 min。起始温度为40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min上升至160 ℃,保持2 min,再以20 ℃/min上升至240 ℃,保持5 min。

1.3.5.3质谱条件

接口温度250 ℃,离子源温度250 ℃,电离方式EI,电子能量70 eV,扫描范围35~500 m/z。

1.3.5.4数据检索

通过计算机对检出的各组分进行检索,以Willey和NIST为检索谱库。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

从大曲、酒醪中分离得到68株具有典型酵母菌特征的菌株。各组中挑选1株代表菌株,共计12株。分别命名为:LY01,LY12,LY14,LY23,LY27,QY03,QY07,QY13,QY15,QY17,QY18,QY20。其结果表明:菌株QY18繁殖方式为裂殖,其他菌株的繁殖方式均为芽殖;菌株LY01,LY12,LY14,LY27,QY07,QY13,QY18产生子囊孢子,其他菌株均不产生子囊孢子;菌株QY03,QY07,QY13,QY17,QY18,QY20形成假菌丝,其他菌株均没有形成假菌丝。

2.2 生理生化鉴定

糖发酵实验中所有菌株均发酵葡萄糖,均不发酵可溶性淀粉,菌株QY07不发酵蔗糖,菌株QY07,QY18不发酵麦芽糖,菌株QY03,QY17可延迟发酵麦芽糖;氮源同化实验中菌株LY01,QY13均可同化硝酸钾、硝酸钠,菌株LY12,QY03,QY07,QY18,QY20同化硝酸钾,其余菌株均不同化。

综合以上实验,根据酵母菌的形态特征与生理生化特性,Bamit的《酵母菌的特征与鉴定手册》和魏景超的《真菌鉴定手册》[22],分离所得12株酵母菌鉴定结果为:LY01,QY13为汉逊酵母属(Hansenula);LY23,QY15为克勒克酵母属(Kloeckera);LY12,LY14,LY27为酵母属(Saccharomyces);QY03,QY17,QY20为假丝酵母属(Candida);QY07为毕赤酵母属(Pichia);QY18为裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

2.3 酵母菌的生产性能实验

2.3.1耐酒精性

图1 酵母菌的耐酒精性Fig.1 Ethanol tolerance test of yeast

由图1可知,菌株LY14,LY27,QY15在酒精度为15%时不能生长,菌株LY01,LY12,LY23,QY03,QY17,QY18,QY20在酒精度为13%时不能生长,菌株QY07,QY13在酒精度为9%时不能生长。

2.3.2酵母菌的产酒、产酯能力分析

图2 酵母菌株产酒精能力Fig.2 Alcohol production capacity of yeast strain

由图2可知,菌株LY14,QY15产酒精能力强,产酒精度高于9%;菌株LY23,QY13产酒精能力弱,产酒精度低于6.5%;菌株LY01,LY12,LY27,QY03,QY07,QY17,QY18,QY20产酒精能力差异不显著,产酒精度均在7%~9%之间。

图3 酵母菌株产酯能力Fig.3 Ester production capability of yeast strain

由图3可知,菌株QY13产酯能力突出,总酯含量接近0.8 g/dL;菌株LY14,LY27,QY03,QY07,QY15,QY17,QY20产酯能力低弱,总酯含量接近0.6 g/dL;菌株LY01,LY12,LY23,QY18产酯能力差异不显著,总酯含量高于0.65 g/dL,低于0.75 g/dL。

2.4 挥发性成分的测定

本实验采用GC-MS方法对图3得出的高产酯菌株LY01,LY12,LY23,QY13,QY18的发酵液中的挥发性成分进行分析,以大曲发酵液为对照。根据风味物质的类别分类,通过峰面积归一化法计算出各样品中风味物质的相对含量,色谱图见图4,成分分析见表1。

图4 大曲(A),LY01(B),LY12(C),LY23(D),QY13(E),QY18(F)的发酵液挥发性香气成分GC-MS总离子流色谱图Fig.4 Volatile aroma components in fermented liquid of Daqu (A), LY01 (B), LY12 (C), LY23 (D), QY13 (E), QY18 (F) analyzed by GC-MS

表1 不同菌株发酵液香气成分检测结果Table 1 Detection results of aroma components in fermented liquid of different strains

续 表

续 表

注:“*”表示具有食醋特征性风味的物质;“-”表示没有检出。

由表1可知,6种不同发酵液共检测出香气成分84种,其中醇类14种,酯类35种,酸类14种,醛类5种,烷烃类8种,烯烃类2种,酮类3种,杂环类3种;相同成分有11种,包括醇类3种,分别是乙醇、正戊醇、苯乙醇;酯类5种,分别是醋酸异戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯;醛类、烷烃类、杂环类各1种,分别是乙缩醛、1-(1-乙氧基)戊烷、2-正戊基呋喃。

大曲发酵液中共检测到50种物质,醇类9种,酯类25种,酸类4种,醛类3种,烷烃类5种,烯烃类2种,酮类1种,杂环类1种。其中草酸含量最高,检出5种具有食醋特征性风味的物质,分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸[23-26]。

菌株LY01发酵液中共检测到38种物质,醇类10种,酯类14种,酸类5种,醛类4种,烷烃类3种,酮类1种,杂环类1种。其中正戊醇含量最高,检出6种具有食醋特征性风味的物质,分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

菌株LY12发酵液中共检测到40种物质,醇类11种,酯类15种,酸类7种,醛类2种,烷烃类2种,酮类1种,杂环类2种。其中正戊醇含量最高,检出5种具有食醋特征性风味的物质,分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、苯乙醛。

菌株LY23发酵液中共检测到36种物质,醇类10种,酯类12种,酸类6种,醛类2种,烷烃类4种,酮类1种,杂环类1种。其中正戊醇含量最高,检出5种具有食醋特征性风味的物质,分别是苯乙醇、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

菌株QY13发酵液中共检测到36种物质,醇类9种,酯类14种,酸类6种,醛类2种,烷烃类2种,酮类1种,杂环类2种。其中乙酸乙酯含量最高,检出5种具有食醋特征性风味的物质,分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、2-甲基丁酸。

菌株QY18发酵液中共检测到35种物质,醇类9种,酯类17种,酸类3种,醛类2种,烷烃类3种,杂环类1种。其中正戊醇含量最高,检出7种具有食醋特征性风味的物质,分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

3 结论

本研究从山河陈醋大曲、酒醪中分离得到12株酵母菌,鉴定结果:LY01,QY13为汉逊酵母属(Hansenula);LY23,QY15为克勒克酵母属(Kloeckera);LY12,LY14,LY27为酵母属(Saccharomyces);QY03,QY17,QY20为假丝酵母属(Candida);QY07为毕赤酵母属(Pichia);QY18为裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。其中,菌株QY15,LY14,LY27产酒性能好,其酒精度分别为9.4%,9.2%,8.8%。菌株QY13,QY18产酯性能突出,其总酯含量分别为0.7832,0.6855 g/dL。采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对6种高粱发酵液中检测出香气成分84种,其中相同成分有11种。6种发酵液分别鉴定出香气物质50种、38种、40种、36种、36种、35种。大曲发酵液中香气成分占总挥发性成分的96.83%,可能因为大曲是自然微生物培养得到的[27],菌类复杂。菌株QY18发酵液中香气成分占总挥发性成分的99.63%,并检出7种具有食醋特征性风味的物质,分别为苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛,相对含量分别为3.86%,22.79%,20.27%,0.07%,0.01%,0.14%,0.01%。

本研究可为陈醋生产的菌种选用及工艺改良提供依据。

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