超高效液相色谱-串联质谱法测定火锅食品中的罗丹明B和6G

吴正双，林显活，梁炽琼,石英

(1.佛山市质量计量监督检测中心，广东 佛山　528225；2.佛山市食品药品检验检测中心，广东 佛山　528000；3.天津工业大学 管理学院,天津　300387)

罗丹明B(又称玫瑰红B或碱性玫瑰精)和罗丹明6G(又称玫瑰红6G或罗丹明590)属于邻苯二酚类化合物，具有荧光染色的作用，在农业、橡胶、染料、医药、生物等领域具有广泛的应用[1-3]。研究表明：罗丹明B和6G可能会引起诱变或致畸，对人体造成急性和慢性中毒伤害[4-6]。2008年，我国卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》(第一批)，将罗丹明B列入非食用物质名单[7]。但由于其具有色泽鲜艳、着色稳定、价格低廉等特点，被大量非法用于食品的生产和加工，特别是被用于火锅食品和其他调味品的染色。

目前，食品中罗丹明B和罗丹明6G的相关检测方法标准有SN/T 2430-2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》和NY/T 2656-2014《饲料中罗丹明B和罗丹明6G的测定 高效液相色谱法》。前者包括高效液相色谱-荧光法和高效液相色谱-串联质谱法，两种方法的前处理过程均比较复杂繁琐，需要经凝胶渗透色谱净化系统净化，且检测限均为5 μg/kg；后者为高效液相色谱-荧光法，定量限为1 μg/kg，虽然前处理比较简单，但是该方法只能通过保留时间定性，容易产生假阳性结果。近年来火锅食品中罗丹明B和罗丹明6G的检测方法主要是高效液相色谱-荧光法和液相色谱-串联质谱法[8-11]。高效液相色谱-荧光法虽然应用广泛，但是由于荧光检测器只能靠保留时间定性，对于基质比较复杂的火锅食品难免不能保证准确性；液相色谱-串联质谱法灵敏度高，特异性强，适用于复杂基质中罗丹明B和罗丹明6G的测定，但是前处理净化方法各异，因此探索一种简单、省时、节省溶剂、净化效果好和回收率高的前处理方法尤为重要。本实验采用固相萃取柱净化样品，经LC-MS/MS多反应监测模式测定，建立了同时测定火锅食品中罗丹明B和罗丹明6G的方法，该方法操作简单快速、灵敏度和准确度高，适用于定性和定量测定。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

罗丹明B(Rhodamine B，98.6%)、罗丹明6G(Rhodamine 6G，98.5%)：均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯，德国Merck公司。

阳离子交换固相萃取柱(3 mL，60 mg)，MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱(3 mL，60 mg)，使用前均依次用3 mL甲醇和3 mL水活化；C18固相萃取小柱(3 mL，200 mg)，使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化；QuEChERS净化小管(填料为无水硫酸镁、PSA和C18混合物)，均购自上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2　仪器与设备

Quattro Premier XE超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)美国Waters公司；OA-SYS水浴氮吹仪美国Organomation公司；电子天平；漩涡式混合器；恒温振荡器；离心机。

1.3　实验方法

1.3.1标准溶液的配制

准确称取罗丹明B和罗丹明6G各5.0 mg，用乙腈溶解并定容至25 mL容量瓶中，均配制成200 μg/mL的单标储备液，置于-18 ℃冰箱中避光保存备用，根据需要用流动相逐级稀释成合适浓度的混合标准工作溶液备用。

1.3.2样品提取

少油型：称取试样1 ～2 g(精确至0.01 g)至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋1 min，超声提取20 min(超声过程中可不时振摇)，涡旋混匀，8000 r/min离心5 min，过滤，滤液待净化。

多油型：称取试样1 g(精确至0.01 g)至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋1 min，超声提取20 min(超声过程中可不时振摇)，涡旋混匀，8000 r/min离心5 min，上清液转移至另一个50 mL离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋1 min，弃去上层液，过滤，滤液待净化。

1.3.3净化

将上述滤液上固相萃取小柱，待其自然流尽后，依次用2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL甲醇洗涤小柱并压干，最后用6 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，流速控制在1 mL/min。洗脱液在50 ℃水浴下氮气吹干。准确加入1 mL 50%乙腈溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤作为测定液，用超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.4液相色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A为0.1%的甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.3 mL/min，梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1　UPLC梯度洗脱程序Table 1 UPLC gradient elution procedures

1.3.5质谱条件

电离方式：电喷雾正离子(ESI+)模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气流：N2，流速600 L/h；锥孔气流：N2，流速50 L/h；碰撞气：氩气，流速0.12 mL/min。

2　结果与分析

2.1　质谱条件的优化

分别取浓度为0.5 μg/mL的罗丹明B和罗丹明6G单标溶液，采用注射泵直接进样的方式，在正离子模式下分别得到其母离子和特征子离子(见图1)，并对透镜电压和碰撞电压进行优化，得到最佳质谱参数，见表2。

图1　罗丹明B(a)和罗丹明6G(b)二级质谱图Fig.1 MS/MS secondary mass spectrogram of Rhodamine B (a) and Rhodamine 6G (b)

表2　罗丹明B和罗丹明6G的多反应监测质谱参数Table 2 MS parameters of Rhodamine B and Rhodamine 6G in MRM mode

注：*表示定量离子。

2.2　色谱条件的优化

分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水流动相体系对罗丹明B和罗丹明6G的分离效果和响应值的影响。结果表明：甲醇-水和乙腈-水分别为流动相时，两种目标物的响应都比较小，且峰形也不够对称。甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水分别为流动相时，峰形明显改善，且响应也增强，但由于罗丹明B和6G为同分异构体，极性相近，甲醇-0.1%甲酸水作流动相，二者保留时间重叠(见图2中a)，而乙腈-0.1%甲酸水可将二者有效分离(见图2中b)，虽然质谱检测不受保留时间的限制，但是乙腈的洗脱效果高于甲醇，不仅可以节省溶剂，而且本实验显示乙腈为流动相时，目标物的响应值也高。因此选用乙腈-0.1%甲酸水为流动相。

a. 甲醇-0.1%甲酸水为流动相

b.乙腈-0.1%甲酸水为流动相图2　罗丹明B和罗丹明6G的总离子流图和MRM图Fig.2 TIC and MRM chromatograms of Rhodamine B and Rhodamine 6G

2.3　提取溶剂的选择

虽然罗丹明B和6G的极性比较弱，脂溶性强，按照相似相溶的原理，应该用非极性溶剂提取，但同时二者又易溶于水、甲醇、乙腈、乙醇等常用溶剂。有标准和文献显示[12]，罗丹明B用乙酸乙酯-环己烷或正己烷提取，经凝胶渗透色谱系统净化，实验浪费大量有机试剂，且检出限比较高，不能满足快速省时和高灵敏度的要求。本实验采用比较节省有机溶剂的甲醇和乙腈作为提取溶剂，并比较了两者的提取效果，发现甲醇在提取出目标物质的同时也提取出更多的极性杂质，不但影响净化效果也导致回收率下降；乙腈极性中等，采用乙腈提取，净化后的样液较为干净，且回收率也高。故实验室采用乙腈为提取溶剂。

2.4　净化条件的选择

因为火锅食品中一般含有大量的油脂和色素等大分子物质和杂质，这些杂质会随着目标物的提取一并提取出来，对色谱柱和质谱离子源损伤较大，因此很有必要对样品提取液进行净化。罗丹明B和6G均为邻苯二酚类化合物，属于弱阴离子型化合物，可以用强阳离子交换固相萃取柱净化，同时也是弱极性化合物，也可以用反相的C18固相萃取柱净化，因此本实验比较了阳离子交换固相萃取柱、C18固相萃取柱、混合型阳离子交换固相萃取柱、商品化的QuEChERS净化小管(填料为无水硫酸镁、PSA和C18混合物)4种方法的净化效果，以回收率评价其净化效果。

结果显示：强阳离子交换柱和C18固相萃取柱都有一定的净化效果，强阳离子交换柱对少油型的火锅食品的净化效果优于C18，但对多油型的火锅食品，C18的净化效果优于强阳离子交换柱。混合型阳离子交换柱是反相和强阳离子交换的复合模式，对少油型和多油型的样品净化效果均比较好。商品化的QuEChERS净化小管使用方便，但是回收率比较低，净化效果不太理想。故本实验选用混合型阳离子交换柱净化样品。

2.5　方法学验证

2.5.1线性范围和检出限

按照相应的仪器工作条件，将1.3.1方法中配制好的罗丹明B和罗丹明6G混合系列标准溶液经自动进样上机测定，以浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性方程见表3。

表3　罗丹明B和罗丹明6G的线性范围、线性方程、相关系数和检出限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and LODs of Rhodamine B and Rhodamine 6G

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对检出限的定义，本实验以空白火锅食品添加低浓度标准物质，使罗丹明B和罗丹明6G的浓度水平均为0.5 μg/kg，按照1.3中的方法均平行测定8次，分别计算出8次测定结果的标准偏差，以标准偏差的3倍作检出限(置信水平P=95%)[13]，得到这2种水平的检出限分别为0.064，0.087 μg/kg。然后，按照1.3中的方法验证，结果显示：罗丹明B和罗丹明6G添加浓度分别为0.064，0.087 μg/kg时，在UPLC-MS/MS仍然有响应，且信噪比S/N>3，考虑到取整数，故确定二者的检出限均为0.1 μg/kg。

2.5.2回收率和精密度

按照实验测定步骤，采用辣椒粉、火锅油底料空白样品，分别添加高、中、低3个浓度进行加标回收实验，每个浓度平行测定6次，考察方法精密度，结果见表4。

表4　罗丹明B和罗丹明6G加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of Rhodamine B and Rhodamine 6G (n=6)

由表4可知，在不同加标浓度条件下，不同的样品中，2种化合物的加标回收率为81.6%～101.1%，精密度范围(RSD)为4.2%～10.4%，能够满足日常检测工作的需要。

3　结论

本实验以火锅食品为研究对象，采用乙腈提取，MCX混合型阳离子交换固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法测定其中可能违法添加的罗丹明B和罗丹明6G。方法前处理过程简单、快捷、节省试剂；混合型阳离子交换固相萃取柱净化效果好，回收率高，为81.6%～101.1%，精密度(RSD)为4.2%～10.4%；检出限低，罗丹明B和罗丹明6G均为0.1 μg/kg。 该方法适用于少油型和多油型火锅食品的检测，可同时定性和定量测定其中的罗丹明B和罗丹明6G，能够满足日常检测工作的要求。

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