亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T、A1298C和G1793A多态性与血液透析患者血浆Hcy水平的关系

2018-04-17聂振禹冯微微陈其军

中国老年学杂志 2018年7期

施　翎　聂振禹　冯微微　崔　宁　吕　敏　陈其军　

(宁波市泌尿肾病医院肾内科，浙江　宁波　315100)

血液透析是终末期肾病治疗的主要手段，但血液透析患者发生心血管疾病的风险升高，探讨预测慢性肾衰竭患者发生心血管事件的风险因素有重要意义〔1〕。同型半胱氨酸(Hcy)水平升高是心血管疾病，尤其是冠心病的高危因子〔2〕。正常情况下血浆中有少量Hcy，大部分Hcy可在细胞内分解，仅有少部分释放至血浆中，而肾脏可清除70%血浆中的Hcy〔3〕。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是Hcy代谢的关键酶，对于维持Hcy正常代谢有重要作用〔4〕。MTHFR的基因多态性分布情况可影响其对Hcy的代谢〔5,6〕，故本研究筛选了3个标签(C677T、A1298C和G1793A)单核苷酸多态性(SNPs)，观察其对血液透析患者血浆Hcy水平的影响。

1　资料与方法

1.1研究对象收集2013年1月至2016年12月于宁波市泌尿肾病医院接受血液透析治疗的88例慢性肾衰竭患者(疾病组)，均为汉族，其中男47例，女41例，年龄30～72岁，中位年龄61.5岁，<60岁37例，≥60岁51例；原发病：慢性肾小球肾炎24例，糖尿病肾病19 例，多囊肾15例，肾小动脉硬化12例，慢性肾盂肾炎9例，肾肿瘤7例，不明原因的肾萎缩2例。患者均接受每周3次的血液透析，每次4 h，血流量和透析液流量分别为250 ml/min和500 ml/min。选取同期92名健康体检者作对比(对照组)，均为汉族，其中男50名，女42名，年龄29～73岁，中位年龄62.0岁，<60岁39例，≥60岁53例。两组年龄及性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2样本收集及处理88例慢性肾衰竭患者均于透析日晨透前空腹收集静脉血5 ml，92例健康体检者于体检当日收集空腹静脉血5 ml，将外周血样本置于含EDTA的抗凝真空采血管中，4 000 r/min离心10 min后，取上清分装成两份，其中一份用于检测MTHFR的基因分型，另一份用于检测血浆Hcy水平。

1.3SNPs位点筛选及基因分型采用Haploview 软件从国际人类基因组单体型图计划(URL:http://www.hapmap.org/index.html.en)筛选出MTHFR基因3个标签SNPs〔C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和G1793A (rs4846049)〕，要求最小等位基因频率 MAF>0.05和连锁不平衡参数r2>0.8。采用宝生物公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，选取纯度、完整度及无降解的DNA标本采用Applied Biosystems进行扩增。苏州金唯智公司设计并合成PCR扩增及延伸引物，采用直接测序法进行基因分型。

1.4血浆Hcy水平检测取制备好的血浆标本，室温复温后采用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测以上标本中的血浆Hcy水平，以上操作均严格遵循试剂盒说明书。

1.5评价指标(1)比较疾病组和对照组C677T、A1298C和G1793A基因型和等位基因的分布差异；(2)比较疾病组MTHFR基因SNPs位点各基因型的血浆Hcy水平；(3)以疾病组血浆Hcy水平的均数为界值分为正常(≤均数)和升高(>均数)，以比值比(OR)及其95%置信区间(CI)评价以上SNPs发生Hcy升高的风险情况。

1.6统计学分析采用SPSS19.0软件。SNP基因型及等位基因型分布比较采用χ2检验，计算调整后的OR及95%CI。

2　结　果

2.1两组MTHFR基因SNPs位点的分布情况疾病组与对照组A1298C基因型和等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)；两组C677T和G1793A基因型和等位基因分布差异有统计学意义(P<0.05)，其中疾病组C677T TT基因型和T等位基因的比例及G1793A AA基因型和A等位基因的比例明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1　两组MTHFR基因SNP位点的分布情况(n)

2.2两组的血浆Hcy水平比较疾病组血浆Hcy水平〔(38.25±4.67)μmol/L〕显著高于对照组〔(19.36±2.59)μmol/L，P<0.05〕；以疾病组血浆Hcy水平的均数为界值将88例患者分为正常(≤19.36 μmol/L)36例和升高(>19.36 μmol/L)52例。

2.3疾病组MTHFR基因SNPs位点基因型与血浆Hcy水平的关系疾病组MTHFR基因A1298C位点各基因型血浆Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)；MTHFR C677T、G1793A各基因型血浆Hcy水平差异有统计学意义(P<0.05)；C677T TT型的血浆Hcy水平高于CC、CT型，CT型的血浆Hcy水平高于CC型，差异有统计学意义(P<0.05)；G1793A AA型的血浆Hcy水平高于GG、GA型，GA型的血浆Hcy水平高于GG型，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　疾病组MTHFR基因SNP位点基因型与血浆Hcy水平的关系

2.4MTHFR基因SNPs位点基因型与血浆Hcy水平的关系

2.4.1C677T以CC基因型为参照， TT基因型血浆Hcy水平升高的风险升高至3.429倍(P<0.05)，而CT、CT+TT型血浆Hcy水平升高的风险未改变(P>0.05)；以C等位基因为参照，携带T等位基因者Hcy水平升高的风险升高至2.050倍(P<0.05)。见表3。

2.4.2A1298C以AA基因型为参照，AC、CC及AC+CC基因型血浆Hcy水平升高的风险未改变(P>0.05)；以A等位基因为参照，携带C等位基因者Hcy水平升高的风险未改变(P>0.05)。见表3。

2.4.3G1793A以GG基因型为参照，GA、AA及GA+AA基因型血浆Hcy水平升高的风险未改变(P>0.05)；以G等位基因为参照，携带A等位基因者Hcy水平升高的风险未改变(P>0.05)。见表3。

表3　MTHFR基因SNP位点与血清Hcy水平升高的关系(n)

3　讨　论

MTHFR在人体叶酸的吸收过程中发挥了重要作用，当该酶发生突变时其活性受影响，不仅影响叶酸代谢，而且会导致体内Hcy水平升高，增加了心血管事件和血栓的发生风险〔7〕。目前报告较多的 MTHFR多态性位点包括C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)，可直接导致MTHFR活性降低〔8，9〕。Hcy在体内是蛋氨酸代谢的中间产物，对于蛋氨酸循环有重要作用，当遗传代谢障碍或机体发生营养物质缺乏时，均可导致Hcy在体内蓄积〔10〕。尽管维持性血液透析是终末期肾病的主要替代疗法，但血液透析对大分子毒素的清除能力较弱〔11〕，而如Hcy等大分子毒素可引起心血管病变等远期并发症，严重影响慢性肾衰竭患者的生活质量〔12〕。

本研究采用直接测序法检测88例接受血液透析的慢性肾衰竭患者的3个标签MTHFR SNPs〔C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和G1793A (rs4846049)〕分布情况，结果提示C677T和G1793A这两个SNPs位点可能参与慢性肾衰竭的发生发展过程。本研究也提示慢性肾衰竭患者接受血液透析过程中出现了Hcy蓄积，MTHFR 677T、G1793A多态性与血透患者的血浆Hcy水平有关，可能与携带突变基因者的MTHFR活性降低有关。

进一步分层分析发现，MTHFR 3个SNP位点中仅C677T与血透患者的血浆Hcy异常升高有关，更加强调MTHFR基因多态性在慢性肾衰竭患者血液透析过程中Hcy升高中的作用，但具体机制尚不清楚，是否与基因突变导致的MTHFR活性降低有直接关系，还需进一步研究。

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2檀国祥,丁婷,叶小栓,等.不同类型缺血性脑血管病血浆同型半胱氨酸水平与神经功能缺损程度的关系〔J〕.中国老年学杂志,2017;37(11):2698-700.

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4田丹丹,张程达,王连珂,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症疗效的关系研究〔J〕.中国全科医学,2016;19(12):1396-400.

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7王爱玲,安翠平,杨卫卫,等.老年心脑血管病患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与血清叶酸、同型半胱氨酸水平的关系〔J〕.河北医药,2016;38(15):2286-8.

8沈宏,张宁.亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T和A1298C位点多态性与胃癌易感性的相关性分析〔J〕.中国普外基础与临床杂志,2015;22(3):351-3.

9张巧慧,柳洁.2型糖尿病患者腔隙性脑梗死与亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性的关系〔J〕.实用医技杂志,2016;23(3):272-4.

10周荣,肖瑾.CRP 及 Hcy 水平与急性期脑梗死和脑出血病变程度的相关性分析〔J〕.中国实验诊断学,2015;19(4):621-3.

11易建伟,何志红,曾逃方,等.不同的透析方案对中、大分子毒素清除与瘙痒症状疗效的关系探讨〔J〕.江西医药,2017;52(1):69-71.