内皮祖细胞移植对老年轻度认知功能障碍大鼠学习记忆功能的影响

程　琳　张培华　张　韡　

(南阳理工学院张仲景国医国药学院，河南　南阳　473004)

内皮祖细胞(EPCs)具有促进血管新生的功能〔1,2〕。近年EPCs移植术在治疗血管相关性疾病一直是研究的热点〔3〕。老年痴呆是目前全世界都普遍存在的医学难题，目前尚没有理想的治疗手段〔4,5〕。而轻度认知功能障碍(MCI)正是介于正常老化和痴呆之间，病患表现出轻度记忆或其他认知功能损害但不影响日常生活能力的一种亚临床状态，是一种可干预的痴呆前状态，也是预防性干预的最佳阶段。本研究探讨EPCs移植对MCI大鼠学习记忆功能的影响。

1　材料与方法

1.1材料140～160 g雄性SD大鼠购自华阜康实验动物中心；α-MEM、L-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；实验过程中使用的单抗均购自美国Santa Cruz公司，其他试剂均为市售分析纯。

1.2EPCs分离培养采用脱颈椎方法处死大鼠后迅速将大鼠浸泡在75%乙醇中消毒10 min，超净台中解剖大鼠，去除大鼠腿部肌肉后分离出股骨和胫骨后使用α-MEM培养液冲洗3次后减去股骺端，使用5 ml注射器吸取标准培养液冲洗骨髓腔，两端各冲洗3次后收集细胞悬液至于1 000 r/min离心10 min后弃去上清液和脂肪层后制备单细胞悬液，接种于75 cm2培养瓶中。24 h后弃去非贴壁细胞，全量更换培养液后每48 h更换1次培养液直至细胞生长至80%～90%融合度后按照1∶2的比例进行传代，传至第3代后弃去培养瓶中的培养基，加入含有20 ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)和20 ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)后继续培养并隔日更换1次培养液，直至大部分细胞呈片状，棒状细胞伴有短突起，多数细胞呈纺锤形后得到EPCs。

1.3老年MCI大鼠筛选选取30周龄以上大鼠至Y-迷宫中，适应3 min后给予电击(电流强度0.7 mA，电压50 V，电击延时5 s)，选择对3臂均探索进入的大鼠，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，后将筛选得到的大鼠进行学习训练。将得到的大鼠随机分为模型组、EPCs组，选取8～10周龄的大鼠作为正常组。

1.4方法将分离培养得到的细胞经消化计数后使用磷酸盐缓冲液(PBS)调整到4×106个/ml，将移植组大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后使用尾静脉注射0.5 ml EPCs悬液，模型组大鼠采用相同操作，且注射0.5 ml PBS。通过Morris水迷宫法在注射EPCs前、注射后1 d、7 d、14 d和28 d进行行为学测定，包括定位航行实验和空间探索实验。各组在完成注射后28 d麻醉。迅速摘取大鼠脑部，并置于液氮中备用。测定脑组织三磷酸腺苷(ATP)酶活力、丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL-6)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；并通过酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒测定脑组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、环鸟苷酸(cGMP)和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。

1.5统计学方法采用SPSS15.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2　结　果

2.1各组平均潜伏期比较在第0天时，模型组和移植组平均潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)，正常组与模型组差异有统计学意义(P<0.05)，表明大鼠处于认知障碍状态。随着训练时间的延长，各组大鼠平均潜伏期均显著低于第0天(P<0.05)，而与模型组相比，移植组在第1天、第7天、第14天及第28天数据均显著降低(P<0.05)，见表1。

2.2各组脑组织相关炎症因子比较模型组脑组织MDA和TNF-α显著高于正常组(P<0.05)；移植组与模型组相比，脑组织MDA和TNF-α水平显著降低(P<0.05)。与正常组相比，模型组SOD和IL-6水平显著降低，而EPCs移植后SOD和IL-6水平显著提高(P<0.05)，见表2。

2.3各组脑组织ATP酶活力、NO、NOS和cGMP含量比较模型组NO、NOS和cGMP含量显著高于正常组(P<0.05)，与模型组相比，移植组NO、NOS和cGMP含量显著降低(P<0.05)。模型组脑组织ATP酶活力显著低于正常组，而移植组脑组织ATP酶活力显著高于模型组(P<0.05)，见表2。

表1　各组平均潜伏期比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05；与本组第0天比较：3)P<0.05，下表同

表2　各组脑组织炎症因子、ATP酶活力、NO、NOS、cGMP含量比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3　讨　论

正常的血液循环是维持机体组织、细胞保持正常生理功能的基本条件。而随着年龄的增加，脑部血流量不足会导致组织局部缺血，导致局部组织能量代谢障碍、活性氧增多，导致局部炎症反应发生，最后炎症反应介导的细胞损伤和细胞凋亡导致组织损伤，进而引起认知功能障碍〔6,7〕。而增加脑部供血不足区域的缺血，可以减少细胞损伤和细胞凋亡，增加脑部修复能力，但是由于缺乏对已经受损的神经元修复和突触间功能的恢复，这类治疗方法目前仍没有取得满意的疗效。基于这样的目的，目前依托于干细胞技术的不断发展，通过从具有较强分化能力的干细胞中获得更好的治疗方法是目前研究热点。骨髓基质干细胞是目前研究最为热门的干细胞，由于获取方便且分化能力强可在体位大量扩增〔8〕。通过在骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养过程中添加神经营养因子和血管生长因子可以使得骨髓间充质干细胞向EPCs定向分化。本研究提示在移植EPCs后大鼠的学习记忆能力显著提高，脑组织炎症水平显著下降。脑部的炎症会导致脑部神经损伤甚至于学习记忆能力相关的神经元凋亡，降低脑部炎症水平有助于恢复学习记忆能力。NO是哺乳动物体内普遍存在的一种强生物活性物质，由NOS催化生成，NO在体内有着广泛的生物学效应，其主要是通过下游cGMP产生作用，与相关研究〔9,10〕本研究显示，EPCs可能通过提高脑组织ATP酶的活力，从而降低脑组织细胞中线粒体损伤，减轻大鼠缺血再灌注损伤。

1杨亚荣,曾秋棠,郎明健,等.内皮祖细胞移植对大鼠心肌梗死后缺血心肌血管再生及心功能的影响〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2008;12(25):4815-8.

2孔朝红,刘煜敏,朱江，等.自体骨髓来源内皮祖细胞移植改善脑缺血再灌注大鼠神经功能转归〔J〕.国际脑血管病杂志,2012;20(4):257-62.

3姜坤,李传勇,孟庆友，等.内皮祖细胞移植治疗慢性深静脉血栓形成的实验研究〔J〕.中华普通外科杂志,2010;25(1):61-4.

4毛梅,张波,傅祖红,等.内皮祖细胞移植对肺损伤炎症状态的影响〔J〕.中国组织工程研究,2013；17(10):1780-4.

5肖方毅,张怀勤,蔡雪黎,等.自体内皮祖细胞移植修复兔动脉内皮损伤〔J〕.中国动脉硬化杂志,2007;15(10):738-42.

6王宁,王护国,姜涛,等.基质细胞衍生因子1α预处理内皮祖细胞移植治疗糖尿病下肢缺血〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2011;15(36):6749-52.

7元荣荣,朱丽萍,李丹丹,等.骨髓内皮祖细胞移植治疗糖尿病大鼠周围神经病变的疗效观察〔J〕.中华内分泌代谢杂志,2015;31(11):982-7.

8于萍,李强,刘颖,等.内皮祖细胞移植对糖尿病兔下肢缺血的病理及血管内皮生长因子的影响〔J〕.中国实用内科杂志,2007;27(15):1207-9.

9张京臣,谢慧,汤鲁明,等.内皮祖细胞移植对油酸诱发兔急性肺损伤时炎性反应的影响〔J〕.中华麻醉学杂志,2014;34(5):627-30.

10徐明国,陶军,王洁梅,等.内皮祖细胞移植修复大鼠颈总动脉内皮损伤〔J〕.中山大学学报(医学科学版),2006;27(4):365-8.