MALDI-TOF MS在短期培养后胸腹腔积液中细菌快速鉴定的应用

芦　嘉

(常州市第一人民医院检验科，江苏常州　213003)

近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为一项准确、快速、经济的鉴定技术在临床微生物检测中发挥着越来越重要的作用，目前的研究热点是临床样本中病原菌的直接检测，但MALDI-TOF MS的鉴定对象必须是细菌的单个菌落[1]，于是如何从样本中获得足量的细菌纯培养就是MALDI-TOF MS普及过程中必须解决的问题。而胸腹腔积液的致病菌检测一直是临床的一项巨大需求，由于胸腹腔积液成分复杂，常规的细菌检测加上药敏试验一般最快也需要2天以上的时间[2]，临床对于缩短检测时间的呼声从未减少过。本研究对常见胸腹腔积液进行短期培养，增菌、离心、洗涤、富集细菌后用MALDI-TOF MS检测，旨在建立胸腹腔积液细菌的快速检测方法并应用于临床。

1　材料和方法

1.1研究对象选取常州市第一人民医院2017年4～10月各科室送检的总计360例确诊为细菌感染患者的胸腹腔积液，其中胸腔积液163例、腹腔积液197例。所有样本均按照《全国临床检验操作规程》留取、运送及保存。

1.2仪器及试剂PHOENIX微生物鉴定仪及配套试剂购自美国BD公司；MALDI-TOF MS检测仪及配套的96孔不锈钢靶板、IVD细菌测试标准品均购自德国Bruker公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)购自美国Sigma公司；哥伦比亚血琼脂平板购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；营养肉汤琼脂培养液购自杭州滨和微生物试剂有限公司。质控菌株包括大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，均购自美国Thermo Fisher公司。

1.3方法每份样本分为三份，一份常规培养并使用微生物鉴定仪检测；第二份离心集菌后用MALDI-TOF MS鉴定；第三份与营养肉汤混合后短期培养2 h，离心洗涤后用MALDI-TOF MS鉴定。以PHOENIX微生物鉴定仪检测结果为标准，评估MALDI-TOF MS对短期培养后胸腹腔积液中致病菌的检测效能。

1.3.1样本的常规培养和鉴定：所有胸腹腔积液用分区划线法接种于哥伦比亚血平板，5 ml/dl CO2孵箱中37℃培养18～24 h。菌落形成后挑取单个菌落配制成0.5麦氏单位的细菌悬液，使用PHOENIX微生物鉴定仪检测。

1.3.2样本直接MALDI-TOF MS鉴定前处理：取5 ml胸腹腔积液于无菌离心管中，2 000×g离心5 min去除细胞成分，将上层液体移至另一无菌离心管中；在20℃下12 000×g离心5 min沉淀细菌，弃上清后在沉淀物中加入1 ml生理盐水洗涤；继续20℃下12 000×g离心5 min，弃上清液后用加样枪吸取1 μl沉淀均匀涂布于靶板孔内，自然干燥后待用。

1.3.3短期培养样本MALDI-TOF MS鉴定前处理：取1.5 ml胸腹腔积液和3 ml肉汤培养液于无菌离心管中充分混匀，2 000×g离心5 min沉淀细胞成分后置5 ml/dl CO2孵箱中37℃培养2 h。之后上清液高速离心沉淀细菌，加生理盐水洗涤，取沉淀涂布靶板孔等步骤同1.3.2。

1.3.4MALDI-TOF MS鉴定：取1 μl甲酸水溶液对靶板孔内的细菌进行裂解，室温干燥。在每个孔位上覆盖1 μl HCCA基质液(含50 g/dl乙腈和2.5 ml/dl三氟乙酸的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液)，自然干燥后放入用IVD标准品校正过的MALDI-TOF MS仪检测。使用配套软件Bruker Biotyper 3.0对得到的蛋白指纹图谱与标准数据库进行比对，得出分值用于判定检测结果，评分>2.0为可鉴定到种水平，评分1.7～2.0为可鉴定到属水平，评分<1.7为不可靠结果。本研究以1.7为界值，达到1.7认为细菌被正确检出，未达到1.7即视为未检出。

2　结果

2.1MALDI-TOF MS对胸腹腔积液短期培养和直接检测的检出率比较见表1。360例样本以PHOENIX微生物鉴定仪的细菌鉴定结果为标准，直接MALDI-TOF MS检测胸腔积液和腹腔积液的正确检出率仅为66.3%和44.7%，总未检出率高达45.6%；而经过短期培养后两种样本的正确检出率分别上升到94.5%和90.9%，总未检出率只有7.5%。

表1

MALDI-TOF MS对胸腹腔积液短期培养和直接检测的检出率[n(%)]

2.2单一细菌胸腹腔积液PHOENIX微生物鉴定仪和短期培养后MALDI-TOF MS检测结果的比较见表2。在360例胸腹腔积液中有322例为单一细菌生长，短期培养后MALDI-TOF MS检测出322例样本中的303例与PHOENIX常规培养的结果相同，其中只能鉴定到属水平的细菌有15株，总体符合率达到了94.1%。322例样本中有19例未能得到正确的鉴定结果。

表2

单一细菌胸腹腔积液PHOENIX鉴定和短期培养后MALDI-TOF MS的比较

注：*括号中数字表示相应细菌只鉴定到属的株数。

2.3混合细菌胸腹腔积液PHOENIX微生物鉴定仪和短期培养后MALDI-TOF MS检测优势菌结果的比较见表3。在360例胸腹腔积液中有38例为2种细菌混合生长，MALDI-TOF MS可以直接从胸腹腔积液中鉴定出优势生长的细菌，与常规培养鉴定得出的优势菌结果基本符合。混合生长的非优势菌主要为棒状杆菌、恶臭假单胞菌、腐败希瓦氏菌、表皮葡萄球菌等常见污染菌。

表3

混合细菌胸腹腔积液PHOENIX鉴定仪和短期培养后MALDI-TOF MS检测优势菌结果的比较

3讨论基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)近年来凭借其快速准确、便捷经济的优势在微生物检验方面得到了广泛的应用。已经有很多国内外学者对MALDI-TOF MS直接检测临床样本中的致病菌进行了研究并取得了大量成果。Nonnemann等[3]使用商品化的预处理试剂盒从阳性血培养瓶中准确鉴定出了致病菌。有学者对单一细菌感染的98例中段尿样本直接进行MALDI-TOF MS检测，检出率为75.5%；而对混合菌感染的中段尿样本，优势菌的检出率为68.8%[4]。随着医疗技术的发展和细菌耐药性的提升，临床需进行细菌鉴定的胸腹腔积液数量呈上升趋势，诊疗过程中得到的胸腹腔引流液在微生物检测中的比重也越来越大。目前绝大多数研究都是直接检测中段尿中的致病菌，而针对胸腹腔积液的研究鲜有报道[5]。因为首先与中段尿相比，胸腹腔积液的成分更复杂，常含有大量细胞和高含量蛋白，这些物质对检测细菌蛋白指纹图谱的MALDI-TOF MS存在巨大干扰；其次是胸腹腔积液中的细菌含量相对中段尿来说普遍较低，易造成检测图谱峰数量过少[6]，特征峰不明显，最终导致直接检出率与中段尿相比明显偏低[7]，鉴定结果无法令人满意。

本研究在中段尿样本直接检测法的基础上，针对胸腹腔积液的特点改进了检测前的样本处理方法：首先加入2倍样本体积的肉汤培养液，混匀后低速离心，有效沉淀细胞和纤维蛋白等有形成分，然后孵育2 h让细菌数量增加，最后高速离心并用生理盐水洗涤得到的沉淀，就得到了足量高纯度的细菌用于MALDI-TOF MS的检测。March Rosselló等[8]对不同细菌浓度的中段尿样本检出率进行了研究，发现细菌数≥105cfu/ml时鉴定正确率很高，随着细菌含量的减少正确率不断下降，而当细菌数<104cfu/ml时基本上就无法得到正确的鉴定结果。本研究中360例胸腹腔积液直接检测法检出率只有54.4%，与样本中细菌含量不足有关，经过常规半定量培养后发现有约一半的样本细菌含量在104～105cfu/ml之间。经过短期培养后，MALDI-TOF MS检测鉴定成功的样本数达到了333例，其中310例评分超过了2.0分。未检出样本27例，其中有14例细菌含量<104cfu/ml；但同时也发现剩下的13例样本虽然细菌含量>104cfu/ml，结果评分却始终<1.7分。这些样本外观均呈粘稠乳糜状，加入肉汤培养液孵育2 h后无论低速或高速离心均无法分离液体成分和固体微粒成分。查询患者病历资料及对样本进行生化免疫检测后发现，这些样本均来自呼吸道或消化道恶性肿瘤患者，其胸腹腔积液中含有大量脂肪微粒，显微镜下可见脂肪微粒与细菌体积相近，仅靠离心无法将两者分离。由于脂肪微粒对加入HCCA基质液时细菌蛋白的结晶化有干扰，极大降低了蛋白的提取效率[9]，故MALDI-TOF MS无法得出正确的鉴定结果。

Wang等[10]通过研究表明，尿液样本中两种细菌的比例达到9∶1时，只有优势菌能被检出；当两种细菌含量在同一数量级时，它们的MALDI-TOF MS图谱会相互影响，导致双方的评分均偏低。本研究中有38例胸腹腔积液为混合菌生长，其中有8例分值<1.7分，经常规培养确认8例样本的两种菌均接近1∶1的比例，临床上也考虑混合感染；而其他30例样本中优势菌都占七成以上，最终证实非优势菌均为取样过程中造成的污染。这一结果与文献相符，可以协助临床对检出细菌是否为污染菌作出判断。

张景皓等[11]对中段尿标本使用血平板短期培养的方法提高了直接检测的准确率，但4h的孵育时间与本研究使用液体培养基所需的2h相比仍然太久。虽然Demarco等[12]提出了一种透析过滤的方法，对胸腹腔积液进行脱盐、分馏、富集等预处理，再使用MALDI-TOF MS检测可达到100%的特异性，但必需使用特定的设备且操作较繁琐并不适用于临床大批量样本的操作。

综上所述，对胸腹腔积液进行2 h的肉汤短期培养，再进行MALDI-TOF MS能得到很高的正确检出率。本方法在鉴定准确性、敏感性、操作便利性和时效性之间达到了一个很好的平衡，能比常规培养方法至少提早12 h出具报告，基本可以满足临床对胸腹腔积液作出快速细菌鉴定的要求。至于目前仍存在的无法检测含大量脂肪微粒样本的问题，可以寻找一种能够吸附或者使脂肪变性的物质，使脂肪微粒能够聚集形成大分子结合物，最终分离得到纯化的细菌，这也是后续研究的一个方向。相信随着技术的继续发展，研究的不断深入和实验操作标准化的持续完善，上述问题都能找到解决方法[13，14]，再加上MALDI-TOF MS在细菌耐药性方面不断取得新的成果[15]，病原微生物鉴定一定会进入质谱分析的时代。

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