ARMS法检测肺腺癌EGFR基因突变及临床意义

李晓锋，刘　希，张冠军，汪园园

(西安交通大学第一附属医院病理科，西安　710061)

肺癌是最常见致命的恶性肿瘤，严重威胁人类健康和生命。研究显示，仅2015年，我国就大约有429万新发恶性肿瘤病例和281万死亡病例，肺癌的发病率和死亡率位于各种肿瘤类型之首[1]。肺癌按组织学分型可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)。其中，NSCLC占原发性肺癌的80%左右。近年来肺腺癌的发病率不断上升，成为最常见的原发性肺恶性肿瘤。尽管肺癌的诊断、治疗已日趋规范，但目前尚缺乏有效的早期筛查的方法，很多患者在就诊时已经为晚期，难以根治，5年生存率仅16%[2]。自2004年表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的作用机制被发现后，针对这一靶点的个体化治疗使NSCLC的预后发生了戏剧性的改变。研究发现，NSCLC体细胞EGFR基因突变状况与NSCLC患者分子靶向治疗获益情况有关，突变的患者对酪氨酸蛋白激酶小分子抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)特别敏感，而EGFR基因野生型的患者几乎不能获益，针对EGFR-TKIs在NSCLC治疗中的出现，其针对特定人群疗效高、副作用小，给这部分患者的生存带来希望。可见对EGFR基因进行突变检测以选择合适的患者进行靶向治疗十分必要[3～5]。课题组所用的扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)法，在实时荧光定量PCR的基础上，利用特异性的引物对DNA靶向序列进行准确的PCR扩增，然后利用荧光标记探针对PCR扩增产物进行检测。本实验采用ARMS法对本院确诊的肺腺癌患者标本EGFR基因突变进行检测研究。

1　材料和方法

1.1研究对象收集2015年1月～2016年8月西安交通大学第一附属医院病理科有住院病历的肺腺癌患者标本，共566例，其中女性254例，男性312例，年龄28～91岁，中位年龄61岁；吸烟者239例，不吸烟者327例；胸腔积液细胞块标本34例，肺活检标本401例，手术切除组织标本131例。

1.2试剂与仪器FFPE DNA提取试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)，人类EGFR基因29种突变荧光PCR检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)，PCR扩增仪(美国BIO-Rad公司的CFX96)。

1.3实验方法采用ARMS完成上述标本EGFR基因突变监测。(1)标本采集：收集本科室石蜡标本，包括微小标本和大体标本。微小标本包括CT引导下穿刺、支气管镜活检等，大体标本为手术石蜡切片、细胞石蜡标本，所有标本在进行EGFR突变检测前均经我们科室医生病理确诊和评估。(2)DNA提取：①切取5 μm厚组织5～8片放入1.5 ml离心管中。②脱蜡及脱苯。③使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的FFPE DNA提取试剂盒提取DNA。(3)DNA的纯度和浓度检测：使用QUAWELL分光光度计检测所提取DNA，要求标本DNAA260 nm/A280 nm在1.8～2.0之间，且A260 nm/A230 nm>2.0，然后将标本DNA质量浓度调整至2 ng/μl。(4)ARMS法检测EGFR突变：使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类EGFR基因29种突变荧光PCR检测试剂盒进行检测。试剂盒应用8联PCR管设计，每管内装有对应的EGFR突变检测试剂及内部质控试剂，将50 μl模板DNA和3 μl Taq酶混匀后，向对应的PCR管内加入5 μl混合液即可构成PCR反应体系。采用BIO-Rad公司的CFX96 荧光定量PCR仪PCR，反应条件按试剂盒说明书设置，并设置对应的阳性、阴性对照。收集到的信号需满足以下4点，则认为检测成功、结果可信：①阴性对照无FAM信号升起；②阳性对照Ct值<20；③外控FAM信号升起且Ct值在15～21之间；④内控VIC信号升起。

1.4统计学分析采用统计软件SPSS22进行统计学分析，对于不同性别、年龄段、标本类型及是否吸烟等EGFR基因突变率差异应用χ2卡方检验及Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果见表1。肺腺癌标本进行EGFR检测，探究EGFR基因突变率与吸烟和非吸烟肺腺癌患者临床病理特征的相关性，对EGFR基因突变与患者的年龄、性别、手术方式及肺癌原发部位进行统计分析。结果显示，吸烟患者EGFR突变率低于非吸烟患者，在吸烟与非吸烟患者标本中EGFR突变率与性别、年龄、标本类型都无明显关联(P>0.05)。也就是说，在排除吸烟因素后，男性和女性EGFR突变率无统计学意义。在肺原发部位中，非吸烟患者在左肺和右肺中EGFR突变率分别为61%和57%，无统计学差异，而在吸烟患者中EGFR突变率分别为41%和25%，有统计学差异，因此，吸烟是EGFR突变率的主要影响因素。进一步统计发现，吸烟对于双侧肺组织都有影响，对于右侧肺组织影响较大。

表1

吸烟与非吸烟腺癌患者EGFR基因突变影响因素分析[n(%)]

3讨论EGFR(络氨酸激酶受体)[6]是一个170 kda具有486个氨基酸跨膜受体蛋白。它属于ErbB家族之一，ErbB的家族总共有四大成员：HER1(erbB1)，HER2(erbB2)，HER3(erbB3)和HER4(erbB4)，均定位于细胞膜。根据肿瘤本身不同，这些受体蛋白表现出不同分布和分子表型改变。EGFR家族成员它们结构都比较相似，包括胞内区、跨膜区和胞外区共三部分组成。胞外区是与其相应配体结合的所在部位。而EGFR跨膜区将受体锚定在胞膜区，酪氨酸激酶活性在调节细胞分化和增殖起着非常重要的作用。EGFR作为NSCLC治疗的重要分子靶标被普遍关注。因此，针对EGFR靶点的药物也在不断发展：包括一代EGFR-TKI吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等；二代EGFR-TKI阿法替尼和三代EGFR-TKI奥希替尼等[7]。2017年V5版美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)NSCLC在临床实践的指南中指出[8]，对于晚期、转移或者复发的非鳞癌的NSCLC患者及非吸烟患者或可取得小的活体组织或肿瘤为混合组织学来源的鳞癌，推荐行EGFR基因突变检测，阳性患者推荐用EGFR-TKIs进行一线治疗。

针对EGFR靶点的研究显示[9～11]，直接测序法的灵敏度很有限，对于肿瘤组织的突变含量至少达到20%才能被检测出来，而实体肿瘤的突变大多是体细胞突变，突变的细胞与野生的细胞常常混杂在一起，因此在所提取的DNA中常有大量野生型DNA混杂，那么就必须要求检测法有相对较高的特异度和敏感度，各方法的敏感度、操作方法的难易程度及检测EGFR突变范围的不同，基于荧光定量PCR技术为基础的ARMS法，根据不同位点设计的特异性探针能够仅识别并扩增EGFR突变序列，在突变信号的收集过程较少受到肿瘤组织中混杂的正常细胞的干扰。ARMS法检测技术在设计上能最大限度地缩短扩增产物的目标长度，避免从石蜡包埋组织(FFPE)标本提取的DNA出现片段化而无法检测到准确结果的难点。ARMS法与测序法相比而言，它的操作简单，敏感性好，能检测到DNA中含量低至1%的突变基因，并且能检测EGFR基因多达29种突变类型。结合RT-PCR平台在扩增时采用了一个闭管操作，简单，不需要产物的后处理，很大程度避免了扩增产物的污染，在临床样品检测比较容易开展[12～14]。我们的研究也表明采用ARMS法，对于大体手术标本、穿刺、支气管镜标本及恶性胸腔积液标本进行EGFR检测，其突变率并无差异，也说明其检测的敏感性和可靠性。

有研究证明，EGFR突变在亚裔、女性、非吸烟患者中高发，与本文结果一致[15]。本文同时也证明，对于男性不吸烟患者，其突变率与女性患者无统计学差异，提示吸烟对于EGFR突变率影响较大，排除吸烟因素后对性别影响较小。有研究表明[16]，EGFR突变与TNM分期、肿瘤原发灶部位及标本类型差异无统计学意义，本研究结果显示EGFR突变与年龄、性别及标本类型无统计学差异，而与肿瘤原发灶部位却有密切关系。与非吸烟患者比较，吸烟患者的两侧肺组织EGFR突变率均降低，其右肺突变率明显低于左肺，提示吸烟对于右侧肺组织影响较大。同时提示，对于晚期无法手术的患者，也可通过肺部、淋巴结穿刺、支气管镜活检或胸腔积液脱落细胞检查进行EGFR检测，从而进行有效的治疗。

综上所述：①EGFR高突变率发生在肺腺癌、亚裔、不吸烟患者等的特异指标；②肺、淋巴结穿刺及支气管镜标本，恶性胸腔积液可替代手术标本进行EGFR检测；③吸烟对于左、右肺EGFR突变率均有影响，但是对于右肺的影响较大；④ARMS法可有效应用于肺癌临床病理石蜡标本中EGFR基因突变检测。

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