HPLC-DAD 法检测盐酸左旋咪唑注射液中左旋咪唑的含量＊

2018-04-16林仙军章荣叶周芷锦汤赛飞王彬陈晓林陆春波

中国动物保健 2018年12期

林仙军，章荣叶，周芷锦，汤赛飞，王彬，陈晓林，陆春波

（1.浙江省兽药饲料监察所杭州 311101；2.台州市屠宰管理所浙江台州 318000；3.浙江建安检测研究院有限公司杭州 310006)

盐酸左旋咪唑是广谱驱虫药和生物反应调节药[1]，对牛、羊、猪、犬、猫和禽的胃肠道线虫、肺线虫及猪肾虫病具有良好驱虫活性[2-3]。盐酸左旋咪唑注射液质量标准收载于《中国兽药典》2015 年版一部[4]，标准采用三氯甲烷萃取、高氯酸滴定法（非水测定法）进行含量测定，方法操作繁琐、费时，高氯酸滴定液能与多种药物反应，专属性不高。检测中所用试剂三氯甲烷、醋酐等对人体有危害性，对环境污染也较严重。

目前文献报道测定盐酸左旋咪唑含量的方法除高氯酸滴定法外，主要以高效液相色谱法为主，有测定饲料[5]、绵羊血浆[6]、猪鸡组织[7]、盐酸左旋咪唑粉[8]、复方盐酸左旋咪唑注射液[9]和万乳康[10]等各类样品中盐酸左旋咪唑的含量，以及盐酸左旋咪唑原料中的有关物质[11]，但目前尚未见高效液相色谱法（HPLC）测定盐酸左旋咪唑注射液中左旋咪唑含量的报道。因此，本研究对完善盐酸左旋咪唑注射液质量标准有促进作用。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配DAD 检测器（美国Agilent 公司）；AG-285 电子天平（Mettler公司）；KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER TOLEDO 320 酸度计（Mettler 公司）。

1.2 试剂与药品

乙腈、甲醇均为色谱纯，德国默克公司；磷酸、三乙胺、盐酸、过氧化氢和氢氧化钠均为分析纯；水为超纯水。左旋咪唑对照品来源为中国食品药品检定研究院，批号100167-201203，含量99.9%。盐酸左旋咪唑注射液来源为浙江凯特道格药业有限公司，批号为20180901、20180902 和20180903，规格为10m L ∶0.25g。

1.3 对照品溶液和供试品溶液的配制

称取左旋咪唑对照品适量，精密称量，用流动相超声溶解并定量稀释制成每1mL 中约含100µg 的溶液，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品适量，用流动相超声溶解并定量稀释制成每1mL 中约含100µg 的溶液，摇匀，作为供试品溶液。

1.4 标准曲线系列溶液的配制

取左旋咪唑对照品适量，用流动相超声溶解并稀释制成每1m L 中含左旋咪唑500µg 的溶液，摇匀，作为对照品溶液。取对照品溶液适量，用流动相稀释成浓度分别为1、5、20、50 和100µg/m L 的溶液。

1.5 高效液相色谱条件和系统适应性试验

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，内径4.6mm，柱长250mm，粒径5μm；用二极管阵列检测器进行扫描，扫描范围为190～400nm，记录212nm 波长处的色谱图，流速：1.0m L/min；进样量：10μL；柱温：30 ℃；流动相为0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液（三乙胺调节p H 值至7.0）-乙腈（80 ∶20，v/v）。

1.6 非水滴定的方法

精密量取本品适量（约相当于盐酸左旋咪唑0.25g），置分液漏斗中，加氢氧化钠试液5m L，稍振摇后，精密加入三氯甲烷50m L，振摇提取。静置分层后，精密量取三氯甲烷液25m L，加冰醋酸15m L、醋酐2m L 与结晶紫指示液1 滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1m L高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于24.08mg 的C11H12N2S·HCl。

2 结果

2.1 标准曲线及线性关系考察

取1.4 项的溶液，按照建立的色谱条件进样检测，得到左旋咪唑对照品溶液色谱图见图1，光谱图见图2。以系列对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，左旋咪唑在1～500µg/m L 浓度范围内线性关系良好，线性方程Y=44.190X+17.116，相关系数r=0.999 99。

2.2 稳定性试验

取批号为20180901 的左旋咪唑供试品溶液，分别于0、2、4、6、12 和24h 进行测定，测得左旋咪唑峰面积为RSD 为1.0%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.3 HPLC-DAD法和非水法比较

分别用HPLC 法和非水法对实际样品进行测定，数据见表1。实际样品色谱图见图3，光谱图见图4。左旋咪唑的含量与非水测定法一致，相对偏差在1.0%以内。

2.4 准确度

按照盐酸左旋咪唑注射液配制方法，分别按2.5、5.0 和10.0mg/mL 三个浓度添加盐酸左旋咪唑原料，每个浓度分别制备5 个平行样品，求得添加回收率及相对标准偏差，测定结果见表2。

图1 左旋咪唑对照品溶液

图2 左旋咪唑对照品溶液扫描光谱图

图3 左旋咪唑注射液供试品色谱图（批号20180901）

3 讨论和小结

1）取标准曲线系列溶液中100µg/mL 对照品溶液，在190～400nm 波长范围内进行DAD扫描。结果左旋咪唑在212 nm 的波长处有最大吸收，见图2。因此，选择212 nm 作为检测波长。

2）用乙腈-水作为流动相时，左旋咪唑色谱峰拖尾较为严重。在流动相中加入三乙胺、磷酸、磷酸二氢钾溶液等改进剂能够抑制解离，改善峰形。本文考察了0.01、0.025 和0.05mol/L 等不同浓度的磷酸二氢钾溶液，添加三乙胺调节p H 值为5.0、6.0 和7.0。结果磷酸二氢钾溶液浓度低，峰形拖尾较严重，磷酸二氢钾溶液浓度提高，色谱峰拖尾得到改善；p H 值越低，峰形越差，出峰时间越快；考察了乙腈的比例对保留时间的影响，乙腈的量15%的时候，保留时间约为40min；乙腈比例为20%时，保留时间约为16min，比较合适。

3）对左旋咪唑的稳定性进行了研究，取左旋咪唑对照品溶液（浓度为500µg/mL）1.00mL，分别加1mol/L 盐酸溶液、1mol/L 氢氧化钠溶液和5%过氧化氢溶液各1mL，放置12h，依法测定。结果左旋咪唑在这三种溶液中均稳定，几乎没有降解。

4）对含量较低或者存在非法添加物干扰的左旋咪唑注射液样品，非水滴定法多数无法准确测定其含量，而高效液相色谱法具有良好的专属性，能够准确测定左旋咪唑的含量，具有明显的优势。因此，建立的方法可用于左旋咪唑的质量控制。

5）高氯酸滴定液对温度敏感，需要根据温度做相应的校正，滴定体积较少，增加操作者的要求，滴定终点判断需要看颜色决定，有一定的误差；相对来说，高效液相色谱法操作简单、结果稳定、可靠，更适用于实践检验工作，值得推广。■