响应面辅助优化黑枸杞中花青素提取及其稳定性初步研究

杨　萍,黄佳蕊

黑枸杞属于枸杞属，味道甘甜，营养物质丰富[1]。黑枸杞中的花青素具有多种药理活性，并且具有珍贵的药用价值，被称为“软黄金”[2]。花青素(属于酚类)是一种水溶性色素[3]，花青素具有明显的抗衰老作用[4]。花青素能够保护人的眼睛[5]，改善关节的柔韧性[6]，增加血管壁的弹性，改善血液循环系统[7]。本试验采用微波辅助和有机溶剂相结合的方法提取黑枸杞中花青素，根据单因素试验结果和Box-Behnken Design[8]试验进行提取工艺的优化，以此提高黑枸杞中花青素的提取率，为黑枸杞花青素的开发利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　仪器

JA1003型电子分析天平(广州市典锐化玻实验仪器有限公司)；721可见分光光度计(无锡久平仪器有限公司)；真空泵(上海真空泵有限公司)；XH-800G型超声微波合成反应仪(南京贝蒂仪器有限公司)；HHS-4水浴锅四孔(金坛市金城硕华仪器厂)；粉碎机(郑州九工机械设备有限公司)；XR-100型恒温干燥箱(临朐县旭日干燥设备厂)。

1.2　材料与试剂

黑枸杞(青海康普生物科技股份有限公司)；无水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、硫酸铜、氯化钾、氯化铁(均为分析纯)。

1.3　黑枸杞花青素的提取

1.3.1预处理(1)取一定数量的黑枸杞，将黑枸杞放在50 ℃的干燥箱中，进行干燥，直到黑枸杞的重量不再发生变化取出。温度降到室温后，用粉粹机将黑枸杞进行粉碎，放在60目的筛子中过筛，最后放于干净的瓶中保存。(2)脱脂：在黑枸杞粉末中，加入一定量的石油醚(1∶10)，震荡半个小时，使脂肪充分溶解，降低黑枸杞中脂肪的含量，真空抽滤，干燥，储存起来备用。

1.3.2工艺流程称取预处理后的黑枸杞粉末→加入有机溶剂→恒温水浴锅加热30 min→微波提取→抽滤→转移至容量瓶→定容→测吸光度→计算花青素提取率。

1.3.3操作方法将预处理后的黑枸杞粉末，精密称取1.0 g置于锥形瓶中，按试验预设定的料液比加入料液比1∶20的有机溶剂，放入超声微波合成仪器中，调整微波功率为200 w，微波时间120 s，转入到50 mL容量瓶中，定容，即得花青素提取液。

1.3.4定性试验将处理的花青素溶液，通过高效液相色谱仪，得到谱图，与花青素标准溶液的谱图进行比较，在525 nm处有峰，说明提取液中有花青素。

1.3.5黑枸杞中花青素提取率的测定(1)花青素标准曲线的建立精确称取0.3 g黑枸杞色素，加入70%乙醇溶液，定容于100 mL容量瓶中，分别吸取6，8，10，12，14 mL转移至50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容，配置成浓度为0.36，0.48，0.60，0.72，0.84 mg/mL的标准溶液，在525 nm处测得吸光度[10]，绘制标准曲线。如图1，确定了以黑枸杞花青素为标品的标准曲线方程y=0.59923x—0.01238，R=0.9994，其中y为实验所得的吸光值(ABS)，x为样品浓度(mg·mL-1)，由实验数据表明，此方程具有良好的线性关系。(2)计算公式提取率(%)=(C×V)/M×1000×100%。C：测得样品溶液中花青素浓度(mg/mL)；V：定容之后溶液的体积(mL)；M：样品质量(g)。

图1 标准曲线

表1　试验设计因素与水平

图2 不同有机溶剂对提取率的影响

图3 微波功率对花青素提取率的影响

1.4　采用响应面法优化提取工艺

根据黑枸杞中提取花青素的五个因素的试验结果，选择其中三个对提取率影响比较大的因素进行试验，利用响应面软件，优化提取黑枸杞中花青素的条件，确定最佳的提取工艺，进一步确定提取黑枸杞中花青素的最佳提取率。响应面分析方案见表1。

2　结果与分析

2.1　有机溶剂的选择

选取有机溶剂的种类：乙醇，甲醇，丙酮。分别精密称取1.0 g黑枸杞置于三个锥形瓶中，按试验预设定的料液比加入料液比1∶20，浓度为70%的乙醇，甲醇，丙酮，调整微波功率为200 w，微波时间120 s，转入到50 mL容量瓶中，定容，即得花青素提取液，测得其吸光度值。

由图2可以看出，提取率按从高到低的顺序依次为：乙醇>丙酮>甲醇，所以在接下来的试验中选取乙醇作为提取剂。

2.2　单因素试验结果

2.2.1微波功率对黑枸杞花青素提取率的影响从图3可知，折线图的趋势是先上升后下降，在200 W时，提取率达到最大。原因可能是，在适宜的范围内，随着超声微波合成仪的功率的升高，黑枸杞中花青素溶液的温度上升，提取率变大。但当微波功率超过250 W时，由于温度过高，破坏了花青素的结构，随之提取率下降。

2.2.2料液比对黑枸杞花青素提取率的影响从图4知，在1∶10-1∶20之间，随着料液比的增加，提取率也在相应的变大。当料液比超过1∶20时，提取率保持平稳。可能因为随着料液比的增加，黑枸杞中的花青素在乙醇溶液中溶解的越充分，提取率也会提高。但当料液比为1∶20时，花青素已经充分溶解到溶剂中，随着料液比的增加，溶解情况也不会发生改变。为了节省资源，故采用料液比为1∶20。

图4料液比对花青素提取率的影响图5微波时间对花青素提取率的影响图6乙醇浓度对花青素提取率的影响图7pH值对花青素提取率的影响

2.2.3微波时间对黑枸杞花青素提取率的影响从图5可知，当微波时间为150 s时，黑枸杞中花青素的提取率最大。折线图的趋势是先上升后下降。原因可能是，在适宜的微波功率范围内，随着时间的加大，花青素提取液的温度相应的升高，随着温度升高而分解，提取率降低。故采用微波时间为150 s。

2.2.4乙醇浓度对黑枸杞花青素提取率的影响从图6可知，折线图呈现出先上升后下降的趋势。造成折线图呈现这种趋势的原因可能是，由于乙醇溶液的浓度不同，其溶液的极性也会发生改变。在70%时达到了最佳的效果。

2.2.5pH值对黑枸杞花青素提取率的影响由图7可以看出，当pH=3时，黑枸杞中花青素的提取率最大。造成这种现象的原因可能是，当pH=1时，由于溶液的酸度太大，破坏了花青素的结构。当pH=5时，酸度下降的太大，不利于花青素的存在。在pH>7时，几乎全部破坏了花青素的结构。故提取液的pH值应为3。

2.3　响应面优化提取工艺

2.3.1回归方程的建立与分析采用软件Design-Expert8.0.6.1中的Box-Benhnken试验设计的原理，通过上面单因素试验所得到的信息，选择微波功率、时间、乙醇浓度等三个因素进行试验，其响应值为提取率。试验方案及结果见表2。

表2　微波辅助有机溶剂提取黑枸杞中花青素试验方案与结果

响应面方差分析见表3。利用Design-Expert8.0.6.1软件对表1数据进行分析，建立如下二次方程：

R=2.18000-0.018750A-0.012500B-0.056250C-0.17500AB+0.012500AC+0.025000BC-0.18375A2-0.17125B2-0.10875C2。

该方程的相关系数R2=0.9398，AdjR2=0.9048，模型拟合度良好。由表3可以看出，整体模型达到了极显著水平(P<0.01)，表示这个二次方程模型极显著，不同处理间的差异程度显著。失拟项(P=0.1568)说明模型选择合适。

表3　响应面方差分析

由表3可以看出，AB、A2、B2达到了极显著水平，交互项影响也达到了极显著水平。所以响应值的变化相当复杂，各项具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二抛物面关系。由表3中的显著性可以看出，对花青素提取率影响的因素按从大到小的顺序依次为微波功率>微波时间>乙醇浓度。

2.3.2响应面及等高线的分析结果由于交互作用对黑枸杞中花青素提取率的影响，所以，在保持一个因素无变化的情况下，对模型进行降维分析。利用Design-Expert8.0.6.1软件，根据上述回归方程分析作出响应面图和等高线图(图8-图10)。从下面的三组图中可知，两两交互作用由大到小依次为微波功率和微波时间，微波功率和乙醇浓度，微波时间和乙醇浓度。

图8 微波功率和微波时间对花青素提取率的影响的等高线及响应面图

图9 微波功率和乙醇浓度对花青素提取率的影响的等高线及响应面图

图10 微波时间和乙醇浓度对花青素提取率的影响的等高线及响应面图

图11 光照时间对花青素稳定性的影响

图12 温度对花青素稳定性的影响

图13 不同金属离子对花青素稳定性的影响

图14 不同pH对花青素稳定性的影响

2.3.3提取工艺的优化及结果验证为了进一步确定最佳的提取条件，用软件Design-Expert8.0.6.1进行优化分析，以得到提取黑枸杞中花青素的最优条件。经过响应面优化分析后，确定的最优条件为微波功率146 w，微波时间116.4 s，乙醇浓度64.8%，此时花青素的提取率为2.18%。由于确定的最佳条件的数据在实际操作中不方便操作，决定将提取条件改为：微波功率146 W，微波时间116 S，乙醇浓度65%。采用改正后的工艺条件进行3次平行试验，得到黑枸杞花青素提取率为2.15%，与模型预测性相差不大，证明这个模型具有一定的可靠性。

2.4黑枸杞中花青素稳定性的研究

2.4.1光照对花青素稳定性的影响取5 mL的花青素浓缩液，放在日光的条件下，每隔2 h测定其吸光度。

如图11所示，可以得知，光照对花青素的稳定性有显著的影响。随着光照时间的增加，吸光值在不断地下降，即说明花青素的含量降低，故花青素应该避光保存。

2.4.2 温度对花青素稳定性的影响分别取5 mL的花青素浓缩液，放在30 ℃，50 ℃，70 ℃，100 ℃的恒温水浴锅上30 min，测定其吸光度值。

如图12所示，可以看出，当温度高于70℃时，花青素的含量明显的下降，说明温度对花青素的影响比较大。所以应该在低温的环境中保存花青素。

2.4.3不同金属离子对花青素稳定性的影响分别取5 mL的花青素浓缩液，分别加入1 mL的浓度为0.1 mol/L的硫酸铜，氯化钾，氯化铁溶液，每隔2 h测定其吸光度值。

如图13所示，三种不同的金属离子对花青素稳定性影响强度的顺序依次为Cu2+>K+>Fe3+。所以，在保存花青素时应远离金属离子。

2.4.4不同pH值对花青素稳定性的影响分别取5 mL的花青素浓缩液，分别调节花青素溶液的pH值为1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，测定其吸光度值。

如图14所示，当pH在1-3的范围时，由于pH=1时，酸度较高，破坏了花青素的结构，所以吸光度值降低。当pH>3时，随着pH值的增加，花青素的吸光度值不断下降。故最好在酸性条件下保存花青素。

3　结　论

采用微波辅助和有机溶剂相结合的方法对黑枸杞中的花青素进行试验，通过五个因素的单因素试验，利用响应面，对微波功率、微波时间、乙醇浓度三个因素进行响应面分析。分析结果表明，上述的因素对黑枸杞中花青素的提取率有显著的影响。模型拟合程度高，误差小。响应面优化法确定黑枸杞在微波功率为146 w，乙醇浓度为65%、微波时间116 s的条件下，提取黑枸杞中花青素的提取率为2.15%，和模型中的预测值2.18%相差不大，结果可靠。

经过对黑枸杞中花青素的稳定性研究后，环境因素能够造成花青素结构的改变，使花青素不稳定。所以花青素应避光、低温保存，酸性条件下，远离金属离子。

参考文献：

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