脂肪干细胞复合聚乳酸共聚物对大鼠骨折愈合后生物力学的影响

赵俊延 陈柳柳 黄志明 董杰 李松军

【摘要】 目的 探讨脂肪干细胞（ADSCs）复合聚乳酸共聚物（PLGA）对大鼠骨折愈合后生物力学的影响。方法 56只成功建模的健康雌性大鼠， 随机分为对照组和实验组， 各28只。实验组大鼠左侧股骨骨折肢作为ADSCs组（采用单纯ADSCs治疗）， 右侧作为ADSCs/PLGA组（采用ADSCs/PLGA治疗）。比较治疗4、8周后各组大鼠患肢股骨近端生物力学参数变化。结果 治疗4、8周后， ADSCs组与ADSCs/PLGA组大鼠患肢股骨剪切强度、最大应力、最大载荷、弹性模量比对照组高， 剪切应变比对照组低， 差异均具有统计学意义（P<0.05）；ADSCs/PLGA组剪切强度、最大应力、最大载荷、弹性模量比ADSCs组高， 剪切应变比ADSCs组低， 差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 ADSCs/PLGA能改善大鼠骨折愈合后的生物力学指标， 可提高骨质疏松骨折愈合力， 且效果优于ADSCs。

【关键词】 脂肪干细胞；聚乳酸共聚物；骨质疏松骨折；生物力学

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.10.113

骨质疏松骨折多发于老年群体[1]， 目前临床治疗多采用内固定植入， 但由于该疾病大多属于粉碎性骨折， 内置物易松动、脱出， 临床疗效并不理想， 再骨折发生率高[2]。随着组织工程学的不断发展， 各类新材料的出现使骨质疏松骨折的治疗有了新的思路。PLGA是聚乙二醇酸（PGA）与聚乳酸（PLA）的共聚物， 是目前常用的支架材料， PLGA具有可塑性与生物降解性良好的优点， 且能促进骨组织的生长[3]；ADSCs在不同条件刺激下可分化成不同细胞， 恢复组织细胞的修复功能， 且易大量获得。本次实验对骨质疏松骨折进行实验报告如下。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

1. 1. 1 实验动物 选取60只成年健康雌性SD大鼠作为研究对象（经筛查达到骨质疏松标准）， 3～4月龄， 体质量160～200 g；大鼠均饲养于室温（20±3）℃下， 每日12 h光照， 自由饮水进食的环境下成长。

1. 1. 2 实验器材 胰蛋白酶、PLGA、胎牛血清、青霉素、骨密度仪、万能力学测定机。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 ADSCs分离和培养 取大鼠3只， 颈椎脱臼处死后常规备皮， 消毒后取颈部、背部及下肢皮下脂肪， 注意分离可见筋膜和血管， 采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次；采用眼科剪将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块， 置于浓度为1.5 g/L的Ⅰ型胶原酶中， 在37℃环境下处理1 h；浸泡液通过100目筛过滤后进行离心分离， 转速为900 r/min， 时间持续10 min；含10%胎牛血清的应用DMEM液重新悬浮、接种。培养过程中需每天进行检查， 移除呈柠檬色或呈紫色的浑浊培养液；待细胞达90%汇合时， 滴入2.5 g/L胰蛋白酶进行传代培养。

1. 2. 2 ADSCs/PLGA复合体的构建 第3代ADSCs100%汇合后， 采用2.5 g/L胰蛋白酶进行处理， 离心后以3×109/L的细胞浓度悬浮细胞；取细胞悬液100 μl， 接种于PLGA， 置于培养皿中， 滴入含胎牛血清的DMEM培养液5 ml， 在37℃， 20 ml/L CO2培养条件下培养24 h；通过胰蛋白酶消化后进行洗涤、离心， 备用。

1. 2. 3 模型制作及分组干预 其余57只雌性大鼠行卵巢結扎摘除术， 常规喂养12周后进行骨密度筛选， 并采用线锯于大鼠双侧股骨粗隆下0.8 cm处造横向骨折， 再通过注射器针头将骨折断口逆行引导， 最后应用克氏针行髓内固定， 制成骨折模型。本次研究成功造模56只大鼠， 随机分为对照组和实验组， 各28只。对照组大鼠不做任何处理；实验组大鼠左侧股骨骨折肢进行单纯ADSCs治疗（ADSCs组）， 植入3×109/L的ADSCs悬液100 μl， 右侧（ADSCs/PLGA组）采用ADSCs/PLGA共聚物注射在骨折周围进行治疗。术后采用青霉素进行抗感染治疗， 正常喂养。治疗4、8周后， 对照组和实验组分别处死14只大鼠， 取出完整股骨， 测量生物力学参数变化。

1. 3 观察指标 通过三点弯曲实验测量大鼠双侧股骨第

4周、第8周剪切强度、剪切应变、最大应力、最大载荷、弹性模量等生物力学参数变化（对照组取双侧均值）。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

治疗4、8周后， ADSCs组与ADSCs/PLGA组大鼠患肢股骨剪切强度、最大应力、最大载荷、弹性模量高于对照组， 剪切应变低于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）；ADSCs/PLGA组剪切强度、最大应力、最大载荷、弹性模量高于ADSCs组， 剪切应变低于ADSCs组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

ADSCs主要从机体脂肪组织中提取得到， 是一种具有向多种组织分化潜能的干细胞。研究发现[4-5]， ADSCs在不同因子刺激下可分化为软骨、成骨、肌肉、神经、脂肪等组织器官， 且ADSCs较易获取， 一次取材即可得到较多数量的细胞， 因此可将ADSCs作为促骨生成的种子细胞。

高分子材料是生物支架材料的重要组成， 被广泛引入骨折的临床治疗中。PLGA是近几年兴起的新型生物材料， 具有良好的生物降解性与相容性， 且无毒， 可塑性强， 广泛应用于医学领域， 具有良好的效果。

本次实验将ADSCs/PLGA共聚物复合体与ADSCs悬液植入骨质疏松骨折大鼠模型， 同时选择未经任何处理的骨质疏松骨折模型大鼠作为对照组， 结果显示， 治疗4周、8周后， ADSCs组与ADSCs/PLGA组大鼠患肢股骨剪切强度、最大应力、最大载荷、弹性模量比高于对照组， 剪切应变低于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）；这说明单纯ADSCs治疗与采用ADSCs/PLGA共聚物复合体进行治疗均能促进愈合， 原因考虑为ADSCs能帮助骨骼修复， 加快骨折愈合[6]。ADSCs/PLGA组剪切强度、最大应力、最大载荷、弹性模量高于ADSCs组， 剪切应变低于ADSCs组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）；这说明ADSCs/PLGA共聚物复合体能提高临床效果与质疏松骨折后骨质愈合质量， 原因考虑为ADSCs能帮助促进新骨生成及血管生长， 而PLGA具有优良的孔隙率及孔径， 保证ADSCs的生长繁殖， 提高ADSCs效果， 加快骨折愈合[7-9]。

综上所述， ADSCs/PLGA能改善大鼠骨折愈合后的生物力学指标， 可提高骨质疏松骨折愈合力， 且效果优于ADSCs。但本次实验仅证明ADSCs/PLGA共聚物复合体在动物实验中具有良好效果， 实际临床疗效需应用临床后行进一步研究。

参考文献

[1] 陈晓虹， 沈慧， 夏杰琼， 等.中老年人骨质疏松性骨折流行病学特点及相关因素.中国老年学杂志， 2016， 36（13）：3299-3301.

[2] 张伟滨.骨质疏松性骨折的外科认识.诊断学理论与实践， 2012， 11（1）：11-14.

[3] 王丹， 姜航航.聚乳酸共聚物复合缓释药物的材料特征与实验应用.中国组织工程研究， 2013， 17（8）：1473-1480.

[4] 姜麗丽， 刘天庆， 宋克东， 等.脂肪干细胞生长特性研究.高校化学工程学报， 2014， 28（2）：275-281.

[5] 杨世茂， 王明国， 李静， 等.富血小板纤维蛋白与富血小板血浆体外释放生长因子的比较及其对脂肪干细胞增殖分化的影响.华西口腔医学杂志， 2012， 30（6）：641-644， 649.

[6] 陈犹白， 陈聪慧， 韩岩， 等.脂肪干细胞分离、纯化和保存：研究进展与未来方向.中国组织工程研究， 2016， 20（10）：1508- 1520.

[7] 崔巍巍， 高田林， 卢应， 等.n-Ag/AD/PLGA功能性材料的制备及生物学性能.高等学校化学学报， 2016， 37（1）：195-200.

[8] 唐宇星， 赵庆， 杨中萌， 等. 聚乳酸共聚物复合脂肪干细胞对骨质疏松性骨折愈后生物力学的影响. 中国组织工程研究， 2017， 21（10）：1577-1582.

[9] 汪玉海， 金丽娟， 高俊， 等. 脂肪干细胞复合PLGA对骨质疏松骨折愈合后生物力学的影响. 宁夏医科大学学报， 2013， 35（3）： 244-247.

[收稿日期：2018-12-19]