真菌毒素对肠道屏障的影响

潘佳雯，王 楠，佟晶晶，王明阳，陈新亮，龙 淼

(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳 110866)

真菌毒素是真菌在生长代谢过程中产生的有毒次级代谢产物[1]。在饲料或原料中的真菌毒素会严重影响畜禽养殖业及饲料工业的发展，目前已知的真菌毒素有 300多种，其中对人和动物危害相对严重的有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)等毒素[2]。真菌毒素有遗传毒性、皮肤毒性、肾脏和肝脏毒性，可致畸致癌，对人类和动物的健康存在严重的威胁[3]。真菌毒素还可引起人和动物的肠道疾病，包括肠上皮坏死[4]、扰乱肠屏障功能、损伤免疫应答，并通过损害生长激素信号间接影响饲料消耗[5]。研究证明，真菌毒素可介导破坏肠屏障的完整性，引起上皮屏障损伤，这可能是由于真菌毒素作用于细胞，引起细胞渗透性改变和易位增加所引起[4，6-8]。正常情况下由肠道上皮细胞、黏膜及肠道菌群组成的肠道屏障系统，可有效防止机体受内源性微生物及其毒素的侵害[9]。但大剂量或长期接触真菌毒素会对肠道屏障造成损伤。

1 肠道屏障

肠屏障是指肠道能够防止肠内有害物质穿过肠黏膜进入其他组织、器官和血液循环结构和功能的总和。肠上皮细胞、肠黏液和肠道菌群对维持肠道屏障完整性起到重要作用。

1.1 肠上皮细胞

肠上皮细胞间的连接有紧密连接(tightjunction，TJ)、桥粒(desmosome)、黏附连接(adhesion junction，AJ)、缝隙连接(gapjunction，GJ)等。其中，TJ在肠屏障中发挥着重要作用。

1.2 肠黏液

肠黏液是维持肠道内环境稳定、发挥肠道功能的关键因素，肠黏液可润滑上皮细胞、维持上皮表面内环境、通过作用肠道免疫系统保护上皮、提供肠道微生物菌群生态位点等起到重要作用[10-12]。在人和动物胃肠道内，黏液填满绒毛并覆盖它们，但不附着于上皮，还可阻止细菌或大于0.5 μm的颗粒穿透黏液层,对维护肠道完整性起到重要保护作用[13]。

1.3 肠道菌群

肠道菌群可分为共生菌、致病菌和条件致病菌。正常条件下，由于大量共生菌存在，条件致病菌并不容易大量繁殖而对肠道造成损伤[14]。肠道菌群和肠道的内分泌与旁分泌、能量代谢与贮存等方面都息息相关，肠道菌群通过其中间产物、代谢能力和基因等影响着机体免疫、代谢等多方面活动。

2 真菌毒素对肠道屏障的影响

2.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对肠道屏障的影响

在镰刀菌属产生的真菌毒素中，单端胞霉烯毒素普遍存在，特别是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)广泛存在于谷物(小麦、玉米、燕麦等)产品中。DON摄入后通常导致动物的各种临床症状，如腹泻、呕吐、采食量减少、体重增加量减少[15-16]。这些症状产生的主要原因是由于DON能对肠道造成严重影响，其作用机理主要是 DON可与肠上皮细胞的60S核糖体亚基结合，引起核糖毒性，导致促分裂原活化蛋白激酶(MAP)激酶活化、细胞生长周期停滞和凋亡[5]。

2.1.1 DON对肠上皮细胞的影响 研究表明，肠上皮细胞是DON的靶标，DON通过改变细胞形态和分化以及细胞毒性作用包括调节黏膜免疫反应、导致免疫抑制或刺激局部免疫细胞和释放细胞因子来影响肠上皮完整性[4,7]。DON毒性主要是通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路和改变动物肠组织生理和免疫功能关键基因的表达，MAPKs信号通路激活导致肠屏障功能被破坏，并通过减少紧密连接蛋白的表达而增加通透性，特别是紧密连接蛋白[17,7]。此外，通过激活MAP激酶途径，DON可诱导肠上皮细胞产生细胞因子或趋化因子，如IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17A和IL-22等，引起促炎反应[18-19]。

2.1.2 DON对肠黏液的影响 使用人黏液分泌的体外细胞系(HT29-16E)以及猪空肠活体试验，来确定DON对肠黏液的影响，发现低剂量DON通过特异性降低膜结合黏蛋白MUC1和分泌黏蛋白MUC2、MUC3的mRNA水平，而减少肠黏蛋白的产生[20]。然而，用DON染毒的饲料饲喂1周～6周后，处理组和对照组动物十二指肠的上皮细胞中，覆盖绒毛和形成隐窝的杯状细胞数量表现出相似性[21]。用DON污染的饲料饲喂肉鸡2周，在真菌毒素攻毒组，黏蛋白MUC2 mRNA表达水平在十二指肠中减少，在空肠和回肠中无明显变化。尽管没有提供试验证明，但黏蛋白O-连接寡糖组合物的这种变化，可能影响黏液层的完整性并调节肠道微生物群的组成[22-23]。

2.1.3 DON对肠道微生物菌群的影响 根据试验定量测定结果显示，大肠中盲肠菌群代谢DON的能力最强[24]；而且DON能被一种毒性较低的鸡肠道微生物代谢产物，代谢为脱环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deepoxy-deoxynialenol，DOM)[25]。DON能显著影响小鼠肠道微生物菌群多样性及物种丰度[26]。有研究表明，包括大鼠、猪、牛和鸡在内的各种动物肠道微生物菌群均可代谢DON[5]。但最近根据16S rRNA微生物群分析表明，啮齿动物中摄入DON污染的饮食并没有显着改变肠道微生物菌群的组成和多样性[27]。根据现有的研究结果，DON可能会也可能不会对微生物菌群造成全局影响。

2.2 玉米赤霉烯酮(ZEN)对肠道屏障的影响

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物，具有类雌激素作用、致畸、致癌作用、生殖毒性，不仅能影响饲料食品安全，而且还可以通过食物链在人和动物体内蓄积，进而危害人和动物的健康[28]。ZEN具有对肠道的细胞毒性，因此它可降低淀粉酶和脂肪酶的活性，有研究表示这可能与细胞凋亡、氧化损伤和基因、蛋白质抑制有关[29]。

2.2.1 ZEN对肠上皮细胞的影响 ZEN降低肠上皮细胞存活率，而不改变体外跨膜电阻(TEER)[30]。这种真菌毒素也上调了一些涉及细胞分化基因(TFF2，BMP4)的表达，并下调了肿瘤抑制基因DKK1，PCDH11X或TC5313860的表达[31]。用ZEN染毒的饲料饲喂猪群1周～6周后，猪肠黏膜厚度、绒毛高度和绒毛与隐窝长度的比例在处理组和对照组中表现出相似，说明ZEN对上皮细胞的影响并不显著[21]。

2.2.2 ZEN对肠黏液的影响 目前仅有少数学者调查研究ZEN对肠黏液的作用。Wan L Y M等用HT29-MTX细胞与Caco-2细胞共同培养，在体外评估ZEN对黏液的影响，结果显示MUC5AC和MUC5B的mRNA表达和蛋白分泌上调，但黏液样糖蛋白的总分泌量却减少，这表明黏液在真菌毒素的作用下逐渐减少。研究推论表明肠道黏液层的破坏很可能对宿主造成有害影响，因为其为病原体黏附和易位提供了更多机会。有研究者用ZEN染毒的饲料饲喂猪1周～6周，结果显示猪群十二指肠的杯状细胞百分比保持不变，这说明ZEN对猪十二指肠的黏液层没有显著影响[21]。

2.2.3 ZEN对肠道微生物群的影响 用含有ZEN的饲料饲喂猪群，发现升结肠中存在可培养菌群，并使用BIOLOG(单一碳源利用法)方法估算微生物多样性和丰富性的区系结构，数据显示ZEN降低了可培养好氧菌的总量；同时试验结果表明，在NOAEL浓度(无可见有害作用浓度)下，猪群被ZEN染毒后会影响升结肠内生物繁殖浓度、生物多样性和代谢活性[33]。后续有研究者表示，ZEN在一定程度上会影响动物肠道微生物区系结构，且真菌毒素毒性越强，对肠道微生物区系结构的影响越大[34]。

2.3 黄曲霉毒素B1(AFB1)对肠道屏障的影响

黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是一组由黄曲霉、寄生曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物，具有强烈毒性，可以引起动物肝脏肿大、病变甚至癌变，对人和家畜的健康产生极大的威胁[35]。有研究表明，AFB1会损伤动物肠道结构，使肠道物理屏障遭到破坏，还能降低十二指肠黏膜厚度和肠绒毛高度、使肠绒毛变得短而细、破坏肠道正常微生物区系，从而影响肠道微生物的屏障功能[36]。

2.3.1 AFB1对肠上皮细胞的影响 用Caco-2细胞代替分化的小肠上皮细胞，测定黄曲霉毒素B1(AFB1)对其细胞毒性作用。细胞毒性作用测定包括细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放、活性氧(ROS)产生和DNA损伤。结果显示，AFB1降低了跨膜电阻(TEER)、抑制细胞活力和生长、增加乳酸脱氢酶(LDH)释放和DNA损伤[37]。所有这些细胞毒性结果可能与细胞内活性氧簇(ROS)产生有关，导致膜损伤和DNA链断裂。在啮齿动物中，AFB1在十二指肠和回肠中引起肠道损伤，其特征在于白细胞和淋巴细胞浸润，这说明AFB1对细胞因子表达的调节有一定影响[38]。目前没有关于肠黏液的明显数据。

2.3.2 AFB1对肠道微生物群的影响 在大鼠体内慢性AFB1攻毒的一项研究中，用16S rRNA测序，观察到结肠中微生物多样性减少，并注意到治疗后对乳酸菌群产生不良影响，而AFB1和菌类的比例保持不变[39]。Galarza-Seeber R等[40]研究了暴露于AFB1肉鸡盲肠中总需氧量、兼性厌氧菌(大肠埃希菌)和乳酸菌群的变化。在试验中AFB1最大剂量(2 mg/kg)时，大肠菌群高出10倍，而对于正在研究的其他微生物群体，仅观察到数值不显着的上升，这表明接触霉菌毒素后肠道上皮屏障的完整性不受影响。

3 小结

随着真菌毒素在人类食品和畜禽饲料中的危害频繁发生，受到了人们越来越多的关注。肠黏膜是宿主的第一个物理、化学和生物防御系统，因此在真菌毒素暴露胁迫下保持肠内稳态起着关键作用。根据本文上述内容可总结出，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)分别通过各种机制，显着影响着上皮细胞的功能，包括增加细胞死亡和细胞毒性、提高单层细胞通透性、减少跨膜电阻(TEER)、TJ蛋白表达受损、细胞内定位和功能、有害应激物，特别是细菌(共生和病原体)从肠管内转移到内环境。由于这些上皮细胞靶向的改变，所以有必要揭示真菌毒素暴露，在引发炎症反应和临床表现如肠道疾病中的意义。

上皮细胞是肠屏障主要的功能组成，越来越多的证据表明肠屏障还涉及其他成分如黏液和微生物群，这些是真菌毒素的新兴靶点。关于黏液，DON无疑是最常见研究对象。在体内试验中，DON对黏液的毒理学影响通常仅通过杯状细胞数量测定来评估。除了这种“杯状细胞数”标准之外，还可通过黏蛋白表达、黏蛋白或黏液组成、黏蛋白O-糖基化等其他各种指标来评估真菌毒素与黏液相互作用。关于微生物菌群，迄今为止已经报道的所有真菌毒素研究，证明了它的有害作用。然而，在慢性暴露作用时，肠内真菌毒素持续存在可能被认为是影响微生物菌群组成显着变化、特定菌群丰度和代谢活性的重要原因。此外，使用转录组学/代谢组学方法评估微生物功能的变化，如信号转导、代谢、COM-复合糖和蛋白质的转运等，可能是评估真菌毒素对健康影响的最佳选择。肠黏膜层、肠黏液、肠道微生物菌群不仅是作为个体，而且在小肠和结肠内是作为紧密连接的整体来确保宿主的体内平衡。真菌毒素与肠屏障相互作用的另一个新难点是考虑上皮细胞、黏液和微生物菌群之间的相互影响，这可能是未来的研究热点。