细胞自噬与PRRSV感染相互作用研究进展

陈小琴,赵一霏,孙 岩,冯晓慧,曹 辉,魏 澍，姚龙泉，张 飞，沈国顺，刘金玲*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161；2.辽宁省动物疫病预防控制中心,辽宁沈阳 110164)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，是威胁当今养猪业最重要的疫病之一，给全球养猪业造成了巨大的经济损失[1]。该病以造成母猪晚期生殖衰竭、仔猪呼吸窘迫、免疫抑制和持续性感染等为主要临床症状[2]。从2006年起，我国南方部分省市陆续暴发了高致病性猪蓝耳病，哺乳仔猪发病率达100%，保育仔猪发病率为70%，育肥猪发病率为20%[3]。怀孕各阶段的母猪也会受到影响，妊娠母猪流产率高达40%以上，母猪病死率可达10%。PRRSV感染后，PRRSV在体内主要感染猪肺泡巨噬细胞，也可以感染淋巴结、扁桃体、胸腺、巨噬细胞和脾等免疫器官，引起免疫抑制[4]。目前PRRSV在我国依然存在，并对我国猪群造成的巨大危害依然存在，但其致病机制还未完全阐明。近期相关研究表明，自噬与病毒感染具有相关性，自噬对不同病毒产生积极或是消极的影响。因此，本文对PRRSV及自噬的相关性进行综述，为阐明PRRSV的致病机制提供参考。

1 PRRSV概述

1.1 PRRSV病原

PRRSV属于一种动脉炎病毒，单股正链RNA，病毒粒子直径为50 nm～65 nm，呈卵圆形，有囊膜，且囊膜上，含糖蛋白GP5、GP2a、GP3、GP4、非糖基化M蛋白和2b蛋白，这些蛋白与细胞受体在病毒复制中起着重要的作用[5]。其中病毒糖基化囊膜蛋白(GP5)是该病毒的主要结构蛋白，它主要参与病毒入侵宿主细胞的过程，并诱导机体产生中和性抗体。此外，糖基化囊膜蛋白GP5还具有诱导细胞凋亡、参与病毒粒子与病毒受体结合的过程等[6]。

1.2 PRRSV的基因型

PRRSV根据基因型将病毒分为美洲型(基因型1型),即VR-2332；欧洲型(基因型2型),即LV型，它们的核苷酸同源性为60%。目前，在我国以美洲型为，主根据其致病性可分为经典PRRSV(C-PRRSV)和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株[7]。最近报道出现4种新型高致病性PRRS病毒(HP-PRRSV)毒株，分别被命名为14LY01-FJ、14LY02-FJ、15LY01-FJ和15LY02-FJ，仔猪和母猪感染后发病率为100%，病死率达40%～80%[8]。不同的毒株对细胞的适应性不同，在体内，PRRSV的所有毒株对肺泡巨噬细胞的适应性最高；在体外，LV仅能适应于巨噬细胞，VR-2332除了能在巨噬细胞上很好增殖外，还可在Marc-145、MA-104细胞系培养，无论那一种毒株都具有免疫抑制特性，给养猪业带来了巨大的损失。

1.3 PRRSV的致病机制

PRRSV是通过呼吸道或生殖道感染猪肺泡巨噬细胞和单核细胞,并在巨噬细胞和单核细胞中增殖分化。当PRRSV进入细胞后，它的病毒囊膜不会直接与细胞膜融合，而是通过细胞上的相关受体结合，经受体调节内吞进入宿主细胞[9]。目前，已发现的相关受体有CD163、硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素、波形蛋白、DC-SIGN、CD151，其中CD163是PRRSV最主要的核心受体，且决定了细胞对病毒的敏感性。唾液酸黏附素主要与病毒上的GP5和M的异源二聚体复合物结合，介导PRRSV胞吞到肺泡巨噬细胞中，因此被视为一个潜在PRRSV的中介。硫酸乙酰肝素在识别PRRSV后，建立一个早期PRRSV的附体和促进PRRSV跟唾液酸黏附素的相互作用。波形蛋白在Marc-145细胞表面与PRRSV的N蛋白相结合并通过在BHK-21转染表达，表明能够增强PRRSV反式传递到靶细胞的能力。CD151属于跨膜蛋白，呈现出多样的细胞功能，包括细胞信号、细胞活化和血小板聚集等，可促进PRRSV的感染，具体作用尚不清楚。总之，这些受体参与PRRSV结合宿主细胞启动PRRSV的感染[10-11]。随后，PRRSV进入肺泡巨噬细胞并在肺泡巨噬细胞中破裂、溶解、崩解，导致肺泡巨噬细胞功能下降或丧失，从而使猪体患病。

2 细胞自噬

2.1 细胞自噬的分类及诱导发生过程

细胞自噬(autophagy)是维持细胞内环境稳态的一种生理现象，是用来降解蛋白及大分子物质和回收受损细胞器的过程[12]。它可以分为宏自噬、微自噬和分子伴侣介导自噬，一般所说的自噬是宏自噬。自噬的发生过程需要5个阶段，即诱导、成核、形成自噬小泡、自噬小泡与溶酶体融合和底物降解[13]。在自噬诱导期，细胞环境受营养物质或病原体的刺激，诱导细胞质内形成游离的双层膜结构，随后慢慢凹陷形成自噬前体(proautophagosome,PAS)，接着PAS结构样膜持续延伸，包裹住大分子物质和受损的细胞器等，从而形成自噬体。然后，自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。随后，自噬体内膜被溶酶体酶降解，同时大分子物质及蛋白质也被降解后释放出一些能量参与物质的活动[14]。总之，细胞自噬实现了细胞本身代谢的需要和某些细胞器的更新，它在细胞生长、发育和疾病发生中起着关键的作用[15]。

2.2 自噬常见的分子标志物

在生理状态下，细胞自噬形成过程相当复杂，它需要一系列的自噬分子维持自身结构的稳定和功能的正常。在此期间，会出现自噬标志物，研究中使用最广泛的分子标志物是LC3(微管相关蛋白1轻链3)，它包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种转化形式，LC3主要参与自噬体膜的形成。在检测细胞自噬中，通过比较组间LC3-Ⅱ的表达水平来测定细胞自噬，也可通过计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值来测定，总之，LC3-Ⅱ是自噬检测的常见标记物[16]。

常用的自噬标志物除了LC3外，还有Beclin-1、p62等。Beclin-1基因最早在小鼠体内发现,其调控编码的蛋白与B细胞淋巴瘤/白血病2基因(bcl-2)相互作用，在病毒的复制中起作用[17]。有研究表明，Beclin-1在心脏中起一定作用，可作为影响心脏细胞自噬的自噬标志物[18]。p62定位于细胞核，在细胞质中合成。自噬发生时，常与LC3-Ⅱ形成复合物，因此，p62是反映自噬活性的标记蛋白。总之，自噬标记物在细胞检测中发挥重要的作用。

2.3 自噬与微生物病原体

自噬是一把双刃剑，可清除病原体的感染，也可为病原体的复制和发育提供有利的条件。

细菌是微生物中的一员，它会产生各种毒力因子与宿主相互作用而致病。沙门菌属是存在肠道中的革兰阴性菌，引起人畜肠炎、伤寒和败血症等。当沙门菌进入宿主机体后，宿主为了维持细胞稳态平衡，将产生自噬现象。而沙门菌为防止宿主免疫清除不断进化，细胞出现异源自噬。所谓异源自噬就是机体通过自噬途径清除和限制病原体在胞内的繁殖。有研究表明，沙门菌中还有一个保守基因，沙门菌质粒毒力基因(spv)，能影响哺乳动物细胞自噬水平，增强宿主菌的毒力，促进细菌在体内的繁殖，而对伤寒沙门菌所致的异源自噬具有抑制作用[19-20]。多种细菌(无形体、李斯特菌、链球菌等)可通过自噬途径被清除，同时可利用自噬繁殖。病毒是一种胞内寄生微生物，它的复制与培养取决于细胞机制的调控。猪瘟病毒是单股正链RNA病毒，当机体感染猪瘟病毒后，会诱导自噬稳态的产生并通过对自噬的调控，促进猪瘟病毒在体内的复制。有研究已证明，自噬体结构有利于猪瘟病毒的复制[21]。蓝舌病是一种重要虫媒传染病，蓝舌病病毒感染明显促进了自噬底物的降解，触发完整的自噬潮反应。由于自噬囊泡的酸化，为病毒复制提供一个有利的环境，从而促进蓝舌病病毒的复制[22]。白斑综合征病毒、日本脑炎病毒、猪圆环病毒等都可以诱导机体产生自噬，细胞机制调控自噬促进病毒的复制。

3 自噬与PRRSV的相互作用

3.1 PRRSV感染诱导自噬体的形成

研究发现，自噬在病毒感染中发挥一定作用，一些病毒可以诱导自噬的形成。祁保民等在鸡马立克病研究中发现了自噬体的形成。宋超辉在电镜下观察到疱疹病毒感染SH-SY5Y细胞，发现空泡及自噬化现象。这些发现使病毒性疾病的致病机制的研究有了进一步的突破，自噬与病毒的相互作用成为各个领域研究的对象。自噬与PRRSV的相互作用也于2013年被证实，PRRSV的NSP5、NSP6和NSP7蛋白和它的受体(包括硫酸乙酰肝素、波形蛋白、CD151、唾液酸黏附素、DC-SIGN和CD163)结合，并诱导细胞自噬体的形成[23]。当PRRSV感染细胞时会改变细胞稳态，为了维持细胞稳态的代谢过程，细胞内出现一系列的自噬变化。孙明霞等[24]用PRRSV的VR-2332株感染Marc-145细胞，并运用透射电镜、激光共聚焦、免疫荧光、Western blot等方法，检测Marc-145细胞内自噬分子标记物，结果表明，PRRSV感染可以诱导Marc-145细胞产生自噬现象，而且发现病毒的复制过程是诱导自噬产生所必须的。

3.2 自噬促进PRRSV的复制

自噬作为细胞的生存机制之一，在病原微生物感染过程中起到重要的调控作用。当病毒感染时，细胞可以通过自噬清除病毒，而病毒可以利用自噬促进自身的复制，如冠状病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒等在感染细胞后利用自噬系统完成细胞的自噬。Chen Q等[25]用PRRSV毒株WUH3感染Marc-145细胞，以雷帕霉素处理感染的Marc-145细胞，结果显示用雷帕霉素处理的细胞病毒的滴度显著升高。为了进一步确定自噬体在PRRSV感染期间是否调节病毒的复制，他再次利用自噬特异性抑制剂(3-MA)处理细胞，在不同时间点观察，PRRSV滴度下降，进一步说明自噬可以促进PRRSV的复制。Pujhari S等[26]也通过雷帕霉素处理感染的细胞。也有研究者用敲除Beclin-1基因的方法验证自噬与PRRSV感染的相互作用，结果表明，敲除Beclin-1基因降低PRRSV的产率。以上研究表明，自噬增强PRRSV的复制。

3.3 PRRSV感染抑制自噬体与溶酶体的融合

自噬形成过程中需要自噬体与溶酶体的融合来降解一些大分子物质。当一些外来病原进入机体后诱导细胞产生自噬，在自噬产生后会出现短期的自噬体样结构。有研究者认为，这种现象的原因可能是自噬体与溶酶体结合受阻造成的。孙明霞等用PRRSV感染含有标记自噬体的转染质粒GFP-LC3的Marc-145细胞和染色标记溶酶体，用激光共聚焦共定位观察，在PRRSV感染的Marc-145细胞内，GFP-LC3点状分布显著增加，且溶酶体与自噬体有很少共定位；而在没有感染PRRSV的Marc-145细胞内，GFP-LC3点状分布少，而溶酶体与自噬体共定位比较多。为了排除其他条件的影响，又用溶酶体特异性标志分子(LAMPl)进行了共定位分析，在未感染PRRSV细胞，其PCC值为0.188；而在PRRSV感染的细胞内，其PCC值仅为-0.017 4，说明PRRSV感染抑制自噬体与溶酶体的融合[24]。

3.4 PRRSV感染促进自噬体的降解

自噬在PRRSV感染阶段发生不同的变化，在自噬体形成期，PRRSV感染会诱导自噬体的形成，而在降解期，PRRSV感染会促进自噬体的降解吗？已有其他的相关研究表明，其他病毒如脊髓灰质炎病毒、小鼠肝炎病毒等会促进自噬体的降解，为了证明PRRSV也同其他病毒一样促进自噬体的降解，Chen Q等[25]做了Lyso-Tracker和LC3的共定位分析、LC3-Ⅱ的周转分析和p62的降解分析试验，证明PRRSV感染Marc-145细胞后诱导了自噬体的形成，并促进了自噬体的降解。

4 小结

病毒与细胞的相互作用是一个极其复杂的过程，目前，自噬在人体疾病中的研究十分流行，而在猪病方面的研究还不太多，不论在何种动物体内，自噬并不是一个单独的体系，它的发生总会伴随着细胞的各种变化与效应。自噬在一些病原物的诱导下，自噬的一些关键因子LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、mTOR等发生变化，根据这些关键因子的变化，判断自噬发生水平。尽管自噬的研究已取得了进展，但针对于临床还是有一些难度，还需要大量的研究与实践，尤其在一些易变的RNA病毒中。已有大量的研究表明细胞自噬在机体免疫机制中起着一定作用，可作为细胞屏障防止细胞感染，但同时为病原体提供感染条件。即使这些研究已经为预防疾病提供了一些方便，但还没有完全弄清自噬是通过什么通路或蛋白控制病原体的感染。因此，还需做更进一步的研究，为控制疾病提供更准确的目标。