线粒体与胚胎质量相关性研究进展

徐梓萌，马盼盼，栾维民，马 馨

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118)

近年来，克隆、体外受精、胚胎冷冻、胚胎移植、胚胎干细胞系培养等胚胎工程相关技术的应用日益广泛，而胚胎质量则是决定胚胎工程成功与否的关键。线粒体作为动物细胞核外遗传的主要物质，与胚胎的质量密切相关，线粒体在胚胎发育中的功能及其对胚胎质量的反映的深入研究能够为胚胎工程相关技术的研究提供可行性技术方法和理论依据。本文对线粒体结构、功能、数量、分布、遗传物质、自噬机制等方面与胚胎质量间联系的研究进展进行综述，并展望了线粒体研究在促进胚胎技术进一步成熟方面的发展前景。

1 线粒体基本功能及在胚胎发育中的作用

1.1 为胚胎发育供能

胚胎发育过程需要大量的能量来供给，诸如纺锤体形成、染色单体分离和细胞分裂等关键步骤。在胚泡着床之前，早期胚胎中主要由母源线粒体通过糖酵解为受精卵供能，之后则转变为氧化磷酸化。乳酸生成/氧消耗比(即糖酵解/ 氧化磷酸化比)、脂质利用率和氨基酸周转等线粒体相关代谢指标，可以用来预测胚胎生存力。受精后的早期胚胎不能立即进行线粒体的合成，卵裂球内每个细胞中的线粒体数量随着细胞分裂而减少，因而胚胎发育过程中有限个数的线粒体的代谢极为旺盛，表现为线粒体膜电位ΔΨm 的升高和ATP含量的增加(受精卵的ATP含量显著高于卵母细胞，胚胎的ATP含量显著高于受精卵和卵母细胞)。而发生发育阻滞的胚胎ΔΨm和ATP水平显著低于正常胚胎;抑制线粒体代谢活性将严重影响胚胎发育导致胚胎发育受阻、非整倍体率增加[1]。已有试验成功使用白藜芦醇调节线粒体代谢功能以提高胚胎质量[2]。线粒体的运转对各阶段胚胎的能量供应至关重要，通过对线粒体供能效率的观察及调节能够估计并调控胚胎的发育效率。

1.2 调节细胞内Ca2+稳态

基于线粒体的钙信号传导在胚胎激活和胚胎干细胞分化中十分重要。线粒体能够储存Ca2+，并与内质网、细胞质基质等结构相偶联，共同参与细胞内Ca2+浓度的动态平衡，从而调控相关生理反应。如卵子受精期间的钙震荡引发线粒体电子传递链(ETC)的激活。受精后胚胎将经历一系列钙信号传导，对基因表达和发育具有长期影响。细胞凋亡与细胞质中的Ca2+浓度升高相关在众多试验[3-5]中得到证实，当多种刺激因子作用于不同细胞诱导凋亡的过程，伴随细胞质的钙超载。细胞内钙离子的升高可通过生成活性氧簇(ROS)、活性氮离子等下游环节破坏细胞内稳态而致细胞凋亡。线粒体Ca2+浓度过高可损害氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation，OXPHOS)作用，并通过电子传递链促进活性氧离子生成，亦可通过改变线粒体膜的通透性，抑制ATP的生成和促进坏死。因此，有人提出了细胞中Ca2+平衡的打破决定细胞凋亡的假说，已经被普遍接受。线粒体调控的钙稳态机制的揭示对于受精卵激活、胚胎发育及凋亡等环节均具有一定程度的指示作用。

1.3 活性氧簇对胚胎发育的影响

线粒体有氧代谢过程生成ATP的同时产生一系列含氧中间产物，称活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)。生物体内的抗氧化酶、激素以及某些维生素、矿物质能够清除ROS，使其在细胞内达到平衡。适宜浓度的ROS是重要的信号转导分子，能促进胚胎增殖分化，线粒体解偶联蛋白2(UCP2)通过ROS介导的Yap途径来调节胚胎神经发生[6]。而由于代谢过于旺盛或清除能力低下使ROS浓度过高则会引起氧化应激，造成细胞中蛋白质、核酸等大分子的过氧化损伤，导致线粒体结构破坏和分布异常造成胚胎永久性发育阻滞，高龄影响胚胎质量的原因中即包括ROS堆积产生的氧化损伤。正常的早期胚胎维持总体低水平的代谢，使氧化应激最小化，仅产生必需的ATP以实现细胞功能。氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体转录因子A表达增强,表明线粒体参与了调节细胞内ROS的动态平衡[7]。常用的ROS阻断剂、清除剂有NAC、catalase、Apocynin、DPI等。对于胚胎各阶段活性氧簇生成与清除机制的进一步研究能够保证线粒体功能更好的发挥，从而提高胚胎工程效率。

1.4 线粒体凋亡通路对胚胎发育的调控

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的程序性死亡,能够选择性地去除老化、损坏或其他不需要的细胞，是胚胎发育的重要组成部分。细胞应激反应或凋亡信号被传导至线粒体，增加线粒体对于蛋白质的通透性，释放细胞色素C。细胞色素C在促进caspase级联反应中发挥重要作用，一旦被释放到细胞质中，即可触发一系列的事件，从而导致核小体裂解，细胞凋亡。bcl-2家族是线粒体介导的细胞凋亡的重要因素，既可以维持细胞存活(bcl-2、bcl-xl、bcl-w、mcl-1、A1/bfl1)，也能够促进细胞死亡(Bax、Bak、bcl-xs、Bad、Bid、Bik、Hrk、Bok)，它们的相对丰度是细胞凋亡阈值的决定因素[8]。国内已有研究通过口服中成药抑制线粒体凋亡通路,下调Bax因子、抑制Cty-c自线粒体中释放,抑制Caspase3表达,进而抑制颗粒细胞凋亡,改善IVF结局，提高其优卵、优胚率[9]。线粒体凋亡通路具体机制的揭示，不仅有助于提高胚胎成活率，或许对于胚胎发育模式的进一步探究也具有一定意义。

1.5 线粒体膜电位的维持与细胞凋亡

线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP或ΔΨm)由质子泵(复合物Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ)产生，是氧化磷酸化过程中能量以电化学势能储存于线粒体内膜的结果。正常的MMP与质子梯度(ΔpH)是维持线粒体氧化磷酸化偶联、产生ATP的先决条件,ΔΨm通过选择性消除功能障碍的线粒体而在线粒体体内平衡中起关键作用，它还是运输离子(H+除外)和蛋白质的驱动力[10]。线粒体功能的评估可以使用TPP+(四苯基鏻)电极进行电膜电位分析。胚胎的发育与线粒体膜电位呈正相关，膜电位越高的线粒体，代谢越旺盛。近来发现多种细胞在机制介导的凋亡中均伴有MMP的下降，MMP降低将会引发一连串细胞凋亡级联反应，最终导致不可逆的细胞凋亡。该过程早于DNA片段化等细胞凋亡早期病理变化,是目前观测到出现时间较早的细胞凋亡迹象。

2 线粒体形态结构与胚胎发育的相关性

随着胚胎的发育,线粒体的形态和位置发生一系列改变,其超微结构的变化与代谢功能的进化密切相关。线粒体总体遵循由基质电子密度高、含少量管泡状嵴的椭圆形未成熟线粒体，向基质电子密度低、含有大量板层状嵴、具有高代谢活性的长条状成熟线粒体转变的发育规律。在受精卵至2细胞期，线粒体呈哑铃状，呈现同心圆状的嵴。 从4细胞到桑椹胚期，线粒体具有较长的横向嵴结构。Au H K等[11]通过电镜观察了人未受精卵母细胞、早期胚胎和发育停滞胚胎的线粒体超微结构，认为线粒体嵴分化不完全会损害早期胚胎的发育。有研究称,异种克隆的牛卵母细胞与山羊体细胞之间不能有效的进行核-质互作，具体表现为出现多分叶形线粒体，从而影响牛-山羊异种克隆胚胎的后期发育[12]。线粒体的形态变化可以作为一个指标，衡量核与质之间是否能有效地进行功能的协调。

3 线粒体分布与胚胎发育

目前关于线粒体分布的研究主要集中于神经科学，胚胎发育方面研究较少。线粒体形态与分布很大程度上取决于于线粒体的不断融合与分裂。线粒体通常分布在需要大量能量供应以及氧化反应较多的部位。在细胞质中，线粒体能以细胞骨架为轨道、由马达蛋白提供动能向代谢旺盛的区域迁移。受精卵中，活跃的线粒体聚集在核反应区。精子注入或锶激活后，线粒体围绕在细胞核周围的卵母细胞表现出正常的胚胎发育能力，而线粒体异常分散的卵母细胞的胚胎发育率明显较低[13]。核聚类和皮质环是卵裂早期最明显的特征。线粒体的分布是一个动态过程，在多种动物的胚胎发育过程中均可见线粒体的重分布，对于线粒体重分布的描述，在不同物种、发育的不同阶段间尚未得出统一的结论。其分布主要有三种描述形式：①集中分布于核周，多见于分裂早期；②均匀分布于细胞质，常见于后期的多细胞卵裂球；③聚集在细胞周边的细胞膜附近，多为未成熟的卵母细胞。

3.1 与细胞骨架的联系

线粒体的分布受细胞骨架控制,在胚胎分裂及能量供给中起关键作用。先前的研究认为，细胞骨架中的微管在线粒体分布中起主要作用。Sun Q Y等[14]通过分别对微管、微丝进行破坏并观察线粒体的运动状态，证明线粒体的易位是由微管而非微丝介导。微管的组装和分解是胚胎发育中最耗能的活动之一，在染色体的精准定位和分离中起着重要的作用。线粒体分布在靠近微管的apico-基底轴上，通过微管运输调节合胞体胚胎顶端的线粒体含量，由运动蛋白将线粒体平均分配给其子细胞，并为合胞体的高速分裂提供局部ATP。抑制线粒体电子传递链(ETC)活性使ATP耗竭，使腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)激活，将会抑制胚胎的中期沟槽延伸的形成[15]。卵母细胞胞质中的线粒体可以在微管的作用下进行移动，这使得不同发育阶段特征性分布的线粒体能更好地发挥作用。近期有试验得出了与之前不同的结果。Yamochi T等[16]等观察到，接受线粒体移植的猪卵母细胞中，植入的线粒体从中心转移到卵母细胞的皮质区域，并沿细胞膜扩散。线粒体的这种运动可以通过细胞松弛素B或细胞-chalasin D抑制，但不能通过秋水仙素抑制，提示线粒体的分布可能有微丝的参与。因此，参与线粒体细胞内分布的细胞骨架结构仍有待验证。

3.2 对泛素定位的影响

泛素(ubiquitin，Ub)是真核细胞内广泛存在的一类小肽，可与受体蛋白共价结合，泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是蛋白质在细胞内降解的主要途径，具有消除错误蛋白、调节功能蛋白、调控基因表达等一系列与胚胎发育密切相关的功能。蛋白质先被泛素标记，然后被蛋白酶体识别和降解，此过程需要消耗能量，而线粒体则可为其提供ATP。蛋白质合成以及细胞核分裂时，纺锤体的形成均在细胞核周边进行，Ub定位在细胞核周边以利修饰，该过程需要线粒体参与以供给大量能量。已有试验证实,胚胎发育过程中泛素的定位与线粒体的分布相互关联，泛素蛋白与线粒体共定位[17]。Lehmann G等[18]研究发现，许多线粒体蛋白被泛素化， 众多UPS结构定位于线粒体、含有线粒体靶向序列且能够与线粒体蛋白质相互作用，整个泛素化机制定位于线粒体。证实了线粒体的基本功能受到泛素-蛋白酶体系统的调控。线粒体与泛素-蛋白酶体系统的互作有效地调节基因的表达，使胚胎正常发育。

4 线粒体数量对胚胎发育的影响

卵细胞胞质的线粒体为早期胚胎提供所需的全部能量，也作为后期每个卵裂球中mtDNA复制的模板，直至囊胚阶段线粒体才会开始增殖。哺乳动物的成熟卵母细胞含有105～108个线粒体，线粒体数量不足的卵裂球将会分裂停滞并发生碎裂。在小鼠和仓鼠模型中的研究表明，在滋养外胚层(TE)中每个细胞的平均线粒体数目比内细胞团(ICM)偏高，而滋养层和内细胞团最终将分别发育成为胎盘和胎儿[19-20]。后期胚胎中线粒体的复制则与线粒体的分裂与融合相关。其过程发生在内质网-线粒体接触位点，两细胞器联合协调mtDNA的合成，并将新复制的核苷分配到子代线粒体[21]。线粒体通过不断地融合与分裂维持稳定的数量与功能，线粒体动力蛋白在其中发挥重要作用。研究发现线粒体融合蛋白与分裂蛋白在胚胎发育中均具有重要功能。Chen H等[22]在其研究中指出，缺乏Mfn1或Mfn2的小鼠会在妊娠中期死亡，Mfn2突变特异性地损害胎盘滋养细胞巨细胞层。Drp1敲除的小鼠胚胎未能进行正常发育调控的凋亡，死于胚胎期第11.5天[23]。可以得出，胚胎线粒体数量具有时间特异性、组织特异性，胚胎发育后期可通过对线粒体融合蛋白与分裂蛋白基因的调控调整细胞内线粒体水平，影响胚胎的发育活性。

5 线粒体DNA对胚胎发育的影响

线粒体基因组为多拷贝基因，约16.7 kb的双链，环状DNA，类似于原核DNA。线粒体基因组复制独立于细胞周期。该DNA编码参与氧化磷酸化的酶。线粒体基因组编码13个蛋白(氧化磷酸化途径的全部部分)，22个转移RNA和2个核糖体RNA。这些基因产物的表达在很大程度上受细胞核控制。

5.1 mtDNA拷贝数对胚胎发育的影响

不同于抑制氧化磷酸化活性会严重影响卵子的体外成熟和胚胎发育，研究表明[24],对于mtDNA复制的抑制不会影响卵子体外成熟和体外受精，但可对后期的胚胎发育潜能产生不良影响。Ssbp1和Polg2是最为熟知的mtDNA复制相关基因，抑制Ssbp1和Polg2将会损伤胚胎造成发育受阻[25]，而mtDNA复制障碍将会导致线粒体生物合成受损。囊胚形成前mtDNA拷贝数较卵母细胞时期短暂下降，且此时的内细胞团处于低耗氧率的未分化状态，而滋养外胚层的mtDNA拷贝数以及线粒体有氧代谢则表现为增加[26],可能与胚胎的附植活动相关。国内有研究表明[27],mtDNA拷贝数与卵母细胞质量及胚胎发育能力成正相关;通过移植外源线粒体可以提高水牛次级卵母细胞的发育潜能。多项研究[28-30]表明，高龄产妇囊胚mtDNA显著增高，与其低生育率、高染色体异常率有一定联系。Wells D[31-32]等研究均支持将mtDNA量化作为衡量胚胎质量、预测胚胎植入潜力的生物标志物。总体看来，胚胎发育早期mtDNA拷贝数的低水平和发育后期mtDNA拷贝数的逐渐升高被认为是有利的，且呼吸功能与mtDNA拷贝数之间并非呈简单的正相关。

5.2 线粒体异质性对胚胎发育的影响

目前的研究认为,早期胚胎中的线粒体全部源自卵母细胞质,为母系遗传,精子中携带的线粒体在进入卵母细胞后被稀释到无法检测的水平或在胚胎内被清除。因此，在不发生突变的前提下，子代的mtDNA应与母亲完全一致。而当突变发生，无论是在亲代还是子代，都有可能出现胚胎mtDNA的异质性。mtDNA位置靠近氧化呼吸链的线粒体膜内侧、缺乏组蛋白保护、异质性母本的母系遗传、父系渗漏等均可能成为其异质性的诱因。mtDNA异质性能够危害个体及其后代的健康,而其危害程度取决于突变DNA的百分比。

线粒体遗传的瓶颈效应可以使母本和子代具有不同水平的异质性。线粒体遗传的第一次瓶颈效应发生在减数分裂，卵母细胞中只有部分线粒体得以进入成熟卵细胞；第二次在受精后的胚胎发育中，约1%的mtDNA能够被选择性的复制，其余99%则会在发育过程中逐渐丢失。选择性的复制的mtDNA可能是由于位于卵母细胞核周围，并且在卵母细胞成熟过程中经历了表观修饰。

6 线粒体自噬机制对胚胎发育的影响

线粒体自噬是维持线粒体质量和调节线粒体数量的关键环节，溶酶体选择性地吞噬膜电位降低的受损线粒体。哺乳动物线粒体自噬通过蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)/E3泛素连接酶Parkin途径介导。PINK1和Parkin在损伤的线粒体上累积，促进它们与线粒体网络的分离，并定向的使其分解。目前发现的相关蛋白还包括ATG32、Nix和p62。受精卵中精子线粒体的降解过程被认为包含有线粒体自噬机制的参与，此外，线粒体的自噬还与能量代谢类型的调节以及mtDNA复制的启动相关。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)重编程过程中，线粒体自噬作用使代谢方式由OXPHOS变为EMP途径为细胞供能[33]。自噬机制对线粒体各种关键功能的维持具有重要意义，对于自噬机制的进一步研究也能够间接促进胚胎工程的发展。

7 前景

对于线粒体与胚胎的研究仍是当今的热点问题,线粒体作用的揭示有助于明确胚胎发育的影响因素，提高胚胎在体内、体外发育的质量。目前已经有通过线粒体移植技术(MRT)提高胚胎质量的方法出现，其来源主要有卵母细胞、颗粒细胞、iPSCs、极体等，其效果有待观察。有学者提出线粒体移植前需进行细胞核与线粒体基因的配型，检测基因组相容性，以达到正常的核质互作。

另外，观测mtDNA不同时期的阈值、线粒体网动态的融合与分裂造成的线粒体数量及分布变化、线粒体基因的表达以及呼吸功能的变化也有助于辅助生殖的发展，如筛选具有较高发育潜能的胚胎，选定更适合的培养及贮存方法等，但应用过程中必须考虑到种属特异性，不同物种间胚胎线粒体演变的共性与差异仍有待进一步探究。