基因编辑技术在顶复门寄生虫研究中的应用

丁莹莹，李 娇，鲍 丽，段 萍，姜 宁，冯 颖，桑晓宇，王 瑶，郭晓改，邢蒙恩，李佳祺，李承桓，武安和，杨 娜*

(1.沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866；2.辽宁省血液中心，辽宁沈阳 110000)

顶复门寄生虫是一类专性胞内寄生虫。一些重要的顶复门寄生虫疾病传播速度非常快，例如由蜱虫和蚊子为媒介引起的泰勒虫和疟原虫疾病[1]。如果对这些疾病不加以控制，将会严重危害人类的健康。近年来，通过基因编辑这一方法，将有助于鉴定寄生虫编码的途径以及某些基因在生命阶段中的调节作用，从而合理设计新型控制方法。

1 顶复门寄生虫基因组的保守序列

顶复门寄生虫中基因组的保守序列，可以成为基因操作技术的靶向目标。由顶端复合体分泌并负责介导宿主细胞内的附着，入侵和增殖的蛋白质，均为保守序列。例如，在有性生殖、裂殖体侵入阶段，其棒状体和微线体分泌的MIC-1，AMA-1和TRAP1致密颗粒[2]；在疟原虫、弓形虫、艾美耳球虫和新孢子虫中保守微粒蛋白质SPATR有助于细胞入侵[3]；在巴贝斯虫、泰勒虫编码有性生殖阶段的几个功能蛋白质基因也是保守序列，包括HAP2、CCp和6-cys蛋白[4]；此外，具有调控机制的关键基因也为保守序列，例如由编码转录因子的Ap2、HMG和Myb基因家族编码序列[5]。通过分析顶复门寄生虫基因组保守序列的功能研究和基因操作技术可确定参与入侵阶段的关键分子[6]。

2 基因编辑技术

基因编辑技术是指通过某种特定的途径使机体内的基因失活或缺失的技术。1980年，胚胎干细胞的分离和体外培养的成功为基因编辑技术奠定了技术基础。1985年，首次证明了哺乳动物细胞中同源重组的存在为基因编辑技术奠定了理论基础。1987年，Thompsson建立了完整的胚胎干细胞基因敲除的小鼠模型。2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家Smithie O[7]和Capecchi M R[8]，表彰他们在有关应用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发现。最传统的遗传操作方法包括基于使用同源重组机制外源DNA导入真核细胞的经典转染，但近年兴起的CRISPR/CAS9技术与之前的技术相比，其成本低、操作简单、快捷高效，最重要的是它能够在活细胞中快速有效地编辑任何基因[9]。

3 基因编辑技术在顶复门寄生虫中的应用

3.1 经典转染技术及其应用

转染技术可用于蛋白表达、基因调控的研究以及疫苗的开发。根据外源基因在细胞内表达时间的长短可将胞内转染技术分为瞬时转染和永久转染两大类。瞬时转染时，外源 DNA/RNA不整合到宿主染色体中，表达水平高，但持续时间很短[10]，转染到胞内的遗传物质可能随着细胞分化或外界环境的改变而丢失。相反，稳定转染时，外源DNA/RNA可整合到宿主细胞染色体上，并且宿主细胞可以长期表达目的基因及蛋白[11]。因此，可根据试验目的来选择瞬时转染或永久转染。细胞转染的主要目的是通过增强或抑制细胞内特定基因的表达来研究基因产物或重组蛋白的功能[12]。瞬时转染应用与顶复门原虫，观察其细胞中分子的表达程度，可筛选到阶段特异性表达的强启动子，从而可以推测出顶复门原虫在各个发育阶段发挥主要的功能基因和管家基因。例如，刚地弓形虫Tubulin1微管蛋白启动子能调控标记分子持续性表达，说明Tubilln1在弓形虫完整的发育过程中发挥功能。此外，通过瞬时转染技术，可以测定许多种间特异性或种间保守的启动子和3′端转录终止调控序列，为进一步稳定转染和功能基因组学研究提供更多可选择的优秀转录表达调控序列。

3.2 CRISPR/Cas9基因敲除技术及其应用

CRISPR系统是由细菌和古细菌通过不断进化的一种免疫系统改造而成[13]，根据Cas蛋白的同源性，可将该系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Gasiunas G等[14]首次确定了TypeⅡ型Cas9核酸酶家族可以定向剪切外源DNA。CRISPR/Cas系统作用机制为：当外源DNA入侵噬菌体时，Cas基因编码的蛋白复合物首先识别噬菌体核酸序列的短间隔序列，然后将该序列整合到自身DNA的CRISPR基因座5′重复序列中，再将新的CRISPR基因座转录成前体crRNA(CRISPR RNA)，然后crRNA、tracrRNA (trans-activating crRNA)和Cas9内切酶形成一个复合物[15]，Cas9内切酶在crRNA的引导下识别保守的间相邻基序，继而对结合位点进行切割。此外，CRISPR/Cas9系统需要Cas9核酸酶和向导RNA(guide RNA,gRNA)的共同作用才能发挥基因编辑功能[16]。近年来，CRISPR/Cas系统可应用与多种顶复门寄生虫中[17]，提高了其编辑效率。过去几十年中，研究人员已经采用了多种基因编辑方法修饰疟原虫基因，但耗时久，且靶向不准确。例如，疟原虫在人体内寄生，引起的疟疾可导致每年约60多万人死亡[18]，对人类的健康造成极大的威胁，Sollelis等[19]利用该系统编辑了恶性疟原虫基因，利用线性质粒破坏了egfp外源性位点。Zhang C等[20]利用CRISPR/Cas9系统编辑了约氏疟原虫基因，实现了高效的基因删除和敲入等位基因置换的试验。弓形虫的亚细胞结构能分泌与入侵相关的保守蛋白，尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的ROPs被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的重要分子。Shen B等[21]利用CRISPR/Cas9系统成功构建rop18基因缺陷的弓形虫GT1株，通过毒力试验发现该虫株毒力下降，证明ROP18在弓形虫GT1株毒力表达有差异。Shen B等[22-23]利用此系统研究棒状体球蛋白，发现ROM4可使微线体蛋白脱落，对虫体侵入宿主细胞有重要意义；隐孢子虫可导致患者发生严重的腹泻，Vinayak R J等[24]通过CRISPR/Cas9技术将隐孢子虫的靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方，使隐孢子虫对氨基糖苷类药物产生耐药性，并能感染小鼠或体外培养的细胞，为治疗隐孢子虫病的药物筛选和疫苗的研发提供了重要的分子基础。杜氏利什曼原能够引起严重的人和动物疾病，目前，米替福星是治疗杜氏利什曼病的唯一药物。Zhang W W等[25]利用CRISPR/Cas9系统，检测到杜氏利什曼原虫的ldmt基因与米替福星抗性有关，为杜氏利什曼原虫药物抗性的研究提供了新的分子基础。Peng等报道了应用CRISPR/Cas9系统实现了内源性基因敲除方法， 重新编辑了克氏锥虫的基因，对3条向导RNA依次进行瞬时转染，从而破坏了含有60多个基因成员的基因家族，证明该基因家族与克氏锥虫表面的黏蛋白、黏液素相关蛋白的表达有关[26]。综上所述，CRISPR/Cas9已经通过外源基因插入，基因标记，增加了靶向位点等。这些都证明了该系统可以提高寄生虫的编辑效率。

4 展望

基因编辑技术可有效地鉴定寄生虫中的靶向分子，经典转染的使用让研究人员对基因与功能关系的研究打开新的局面，而CRISPR/Cas9技术的引入，对研究顶复门寄生虫基因发挥了重要的作用，大大提高了基因编辑效率，并加快了特异性疫苗的研究进展。虽然CRISPR/Ca9系统依然存在一些弊端，但随着研究人员对该系统的优化和升级，CRISPR/Ca9技术将会更好的帮助科学家们在基因水平上认识寄生虫，从而有效防治寄生虫病，保障人类和动物健康。