防褐化剂对南方红豆杉愈伤组织褐化及相关物质含量的影响

李 张，徐志荣，娄佳兰，谭小林，刘怡婷，上官桃凤，魏赛金



防褐化剂对南方红豆杉愈伤组织褐化及相关物质含量的影响

李 张，徐志荣，娄佳兰，谭小林，刘怡婷，上官桃凤，魏赛金*

（江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045）

研究了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(AC)、抗坏血酸(VC)、柠檬酸(CA)和硫代硫酸钠(hypo) 5种防褐化剂对南方红豆杉愈伤组织的生长及褐化情况的影响。测定不同时间愈伤组织中多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性及酚类物质含量的变化。结果表明，PVP对细胞生长促进效果最好；第20天时hypo处理的PPO活性最低，低于对照78.77%，第15天时VC处理的POD活性最低，低于对照604.92%；第20天时，CA处理的总酚含量最低，低于对照108.82%。所选的5种防褐化剂在降低红豆杉细胞褐化均具有一定效果。

南方红豆杉；愈伤组织；防褐化剂；酚类物质；酶活性

南方红豆杉(var.)又称紫杉，为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属()植物，主要分布于中国南方地区，是红豆杉属中分布最广、生长最快的一种，为国家一级保护树种[1]。其含有的紫杉醇属四环二萜酰胺类化合物，是一种对治疗肺癌、卵巢癌等有特效的抗癌药物，是当前公认的广谱、活性强的一线抗肿瘤药物[2-3]。传统获得紫杉醇的方法主要是从红豆杉的根皮、茎、叶中来提取，由于提取工艺较为复杂、设备投资大、原料缺乏而严重受限，而采用的植物细胞培养技术生产紫杉醇具有很大潜力[4]。但由于红豆杉属植物本身特殊的生物学特性，在培养过程中组织和细胞常发生褐化，轻则影响组织细胞生长和繁殖，重则导致组织细胞死亡，已成为制约这一技术推广的最大障碍，所以有效地防止和解决组织培养中的褐化是当今研究的热点[5]。

研究认为，酚类物质经过多种氧化酶如多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）催化后形成醌类物质，再通过聚合作用产生有色物质而导致组织呈褐色，即为褐变[6]。这种褐色物质逐渐扩散到培养基中，毒害整个组织并严重影响愈伤组织的生长与代谢，也是一些植物组织培养能否取得成功的决定性因素。褐化发生与外植体体内酚类物质的含量呈正相关，而酚类化合物种类较多，不同植物类型所含的酚类物质种类各不相同，寻找酶促褐变的主要底物能为控制组培褐化提供重要的理论依据[7]。

本试验拟通过向培养基添加不同类型的防褐化剂，探究其对已褐化的南方红豆杉愈伤组织的生长及褐化情况的影响，测定愈伤组织中PPO和POD活性及酚类物质含量的变化。旨在为抑制红豆杉愈伤组织褐化提供一定的科学依据，为进一步揭示与褐化相关的物质基础提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南方红豆杉愈伤组织：以南方红豆杉一年生枝条为外植体经诱导后获得，继代培养至5代以上[8]； B5培养基：青岛海博生物。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验设计

1.2.1 抗氧化剂处理 用不同抗氧化剂处理继代后的褐化愈伤组织，抗氧化剂为过滤灭菌后的硫代硫酸钠(hypo)、柠檬酸(CA)、抗坏血酸（VC），浓度分别为100 mg/L，以不添加抗氧化剂为对照。每个处理设置3个重复，每隔5 d观察愈伤组织生长及褐化程度并检测细胞中PPO和POD活性及酚类物质的含量。

1.2.2 吸附剂处理 分别向固体培养基中加入活性炭(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，浓度分别为0.5 g/L，以不添加吸附剂为对照。每个处理设置3个重复，每隔5d观察愈伤组织生长及褐化程度并检测细胞中PPO和POD活性及酚类物质的含量。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 细胞生长指数的测定 生长指数=（收获量–接种量）/接种量×100%

1.3.2 愈伤组织褐变强度测定 观察愈伤组织的颜色，并按其褐化程度可以将其分为4个等级：1 级：表示没有褐化，表示符号（–）；2 级：表示轻微褐化，表示符号（+）；3 级：表示褐化严重，表示符号（++）；4 级：表示褐化非常严重，表示符号（+++）。

1.3.3 PPO和POD活性测定 PPO提取与活性测定参照张月玲等[9]方法；POD提取与活性测定参照隋丽等[10]方法。

1.3.4 总酚含量的测定 总酚提取：取愈伤组织1 g，加甲醇研磨成匀浆，用甲醇定容10 mL，55 ℃超声提取30 min，4 000 r/min离心10 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后的滤液为待测提取液。总酚含量测定方法采用福林酚法[11-12]测定。

1.4 数据处理

数据采用DPS数据处理系统进行数据统计，误差分析采用Duncan新复极差法；作图采用Origin 8.5.1软件。

2 结果与分析

2.1 不同防褐化剂处理对外植体褐化的影响

褐化的愈伤组织(图1A)经防褐化剂处理后，重新长出状态较好的愈伤组织(图1B)。每个处理下的个体差异较大，整体的褐化状况如表1所示。

表1 第20天愈伤组织褐化程度

图1 对照与防褐化剂处理愈伤组织生长状态

2.2 不同防褐化剂处理对细胞生长指数的影响

由图2A可知与对照相比，5种防褐化剂在不同时期均对褐化细胞的生长有促进作用，其中以PVP效果最好，在第20天时，PVP的细胞生长指数为112.18%，CA为44.20%，VC为40.32%，hypo为39.31%，AC为27.72%，CK为17.83%。

2.3 不同防褐化剂处理对总酚含量的影响

第5天时，PVP和AC处理的总酚含量均高于对照，而hypo、VC、CA处理的胞内总酚含量低于对照，随着时间的增加，PVP处理的总酚含量逐渐低于对照，而AC处理的胞内总酚含量仍高于对照。第20天时，CA处理的总酚含量最低，低于对照108.82%，其次为hypo处理，总酚含量低于对照77.50%（图2B）。

图2 不同防褐化剂处理对细胞生长指数和总酚含量的影响

2.4 不同防褐化剂处理对PPO活性的影响

由图3A可知，在培养的第5天，PVP和AC处理的PPO活性高于对照，而hypo、VC、CA处理的PPO活性低于对照，hypo处理的PPO活性最低，低于对照166.18%；随着时间的增长，PVP和AC处理的PPO酶活性逐渐低于对照酶活性，hypo、VC、CA处理的PPO酶活性呈先增后减的趋势；15 d以后，所有处理的PPO活性均低于对照，第20天时，hypo处理的PPO活性最低，低于对照78.77%。

2.5 不同防褐化剂处理对POD活性的影响

在培养的第5天，对照POD活性均高于防褐化剂处理，PVP、AC处理的POD活性高于hypo、VC、CA处理的POD活性；随着时间的增长，PVP和AC处理的POD酶活性逐渐低于对照酶活性，hypo、VC、CA处理的POD酶活性呈先减后增的趋势；第15天时，所有处理的POD活性均低于对照，VC处理的POD活性最低，低于对照604.92%（图3B）。

图3 不同防褐化剂处理对PPO和POD活性的影响

3 讨 论

褐化是复杂的生化过程，就是组织内或伤口处分泌的酚类化合物在多酚氧化酶等作用下发生的氧化反应从而形成了褐色的醌类物质，酶促褐化必须具备酶、底物和氧3个条件[13-14]。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料中的蛋白质发生聚合，引起酶系统失活，从而导致植物细胞代谢紊乱生长受阻[15]。

叶梅、罗晓芳等[16-17]的研究表明，多酚氧化酶的活性与组织培养材料的褐变不呈正相关，但酚类物质的总含量与褐变有一定的关系。与PPO相比，POD参与酶促褐化反应的作用非常有限[18]。印芳等[19]在蝴蝶兰的研究中发现，褐化程度高的品种，总酚含量也较高。

防褐剂一般可分为抗氧化剂和吸收剂两大类，PVP和AC作为吸附防褐化剂，对褐化细胞的生长有促进作用，其对PPO和POD酶活抑制效果一般，能降低的细胞中总酚含量，其可能的作用机制是防褐化吸附剂通过降低培养基中总酚含量来达到防褐化效果。hypo、VC、CA作为抗氧化防褐化剂，能明显抑制PPO和POD酶活，这是因为抗氧化剂防褐化剂能与酶发生竟争性结合的，从而降低酶活，降低酶促褐化，减少有害物质对细胞的毒害。

本试验所选的5种防褐化剂在降低红豆杉细胞褐化均具有一定效果。从抑制PPO和POD酶活性效果来看，抗氧化防褐化剂效果好于吸附防褐化剂；添加抗氧化防褐化剂的红豆杉细胞中总酚含量低于吸附防褐化剂。抗氧化防褐化剂中，综合比较，hypo抗褐化效果最好，其原因有可能是加入VC和CA会使培养基pH值下降，影响细胞生长代谢。所以培养基中添加防褐化剂浓度应该控制在即具有显著防褐化效果，又不影响外植体的生长分裂和分化。

综上所述，向培养基中加入防褐化剂，可减轻愈伤组织褐化，细胞酚类物质含量减少，PPO和POD活性下降。因此，通过降低愈伤组织中总酚含量和PPO、POD活性来抑制褐化在理论上是可行的。在后续的研究中，需要寻找并调节与总酚含量直接相关的酶、PPO、POD及其基因的表达，从而达到抑制红豆杉愈伤组织褐化的目的。

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Effects of Browning Antagonists on Callus Browning and Its Related Substance Contents in

LI Zhang, XU Zhi-rong, LOU Jia-lan, TAN Xiao-lin, LIU Yi-ting, SHANGGUAN Tao-feng, WEI Sai-jin*

(College of Biological Science and Engineering/Jiangxi Agricultural Microbial Resource Development and Utilization Engineering Lab, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

var.callus were selected as suitable materials and treated with a variety of different browning antagonists, including polyvinyl pyrrolidone (PVP), activated carbon (AC) , vitamin C (VC), citric acid (CA) and sodium thiosulfate (hypo), and the effects of them on the growth and browning ofvar.callus were assessed. The changes in the activity of polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) and the content of phenolic acids in the callus in different time were measured. The results showed that PVP had the best effect on cell growth; Activities of PPO were reduced by 78.77% at their lowest levels under treatments with hypo in the 20th day, and activities of POD were reduced by 604.92% at their lowest levels under treatments with VC in the 15th day; Total phenolic content was decreased by 108.82% at their lowest levels under treatments with CA in the 20th day. SO, 5 browning antagonists were effective to reduce callus browning invar.callus.

var.; callus; browning antagonists; phenolic compounds;enzyme activity

Q942.5

A

2095-3704（2018）01-0069-05

2018-01-26

江西省科技计划项目（20133BBG70090）和江西农业大学大学生创新创业训练项目（201710410067）

李张（1993—），男，硕士生，主要从事植物生理学研究，905092083@qq.com；

通信作者：魏赛金，教授，博士，weisaijin@126.com。

李张, 徐志荣, 娄佳兰, 等. 防褐化剂对南方红豆杉愈伤组织褐化及相关物质含量的影响[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(1): 69-73.