下瘀血汤抑制肝癌细胞生长的研究*

张　浩 ，邵建国 ，卞兆连 ，张　玉

（1南京中医药大学，江苏210023；2南京中医药大学附属南通市第三人民医院；3南通市肝病研究所）

原发性肝细胞肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，其发病率在世界范围内逐年上升，我国每年死于肝癌人数占全球50%[1]。目前肝癌患者的5年生存率不到10%，死亡率位于各大恶性肿瘤第3位[2]。导致原发性肝细胞肝癌的主要病因包括病毒性肝炎、酒精性肝病、代谢型等多种因素，其中病毒性肝炎是最常见的因素。近年来，中医药治疗肝癌已显示一定的优势，并积累了丰富的临床经验。下瘀血汤出自《金匮要略》，最初用于治疗妇女产后瘀血内停致少腹疼痛。研究表明，下瘀血汤可干预实验性肝硬化的形成，能抗肝纤维化、防治肝硬化[3]。全国名老中医周岱翰教授[4-5]在运用下瘀血汤治疗消化道肿瘤，尤其肝癌积累了丰富经验。本研究采用肝癌HepG2细胞体外实验的方法，旨在进一步研究下瘀血汤对肝细胞肝癌的治疗作用及其机制，为中医药治疗肝细胞肝癌提供依据，报告如下。

1　材料与方法

1.1材料10只SD级大鼠，雌雄不拘，体重200±20g，实验期间各组大鼠均饲养于南通大学实验动物中心，自由饮水，进食大鼠基础饲料。人肝癌细胞HepG2（南通市肝病研究所），DMEM高糖完全培养基（上海立菲生物有限公司），胎牛血清、胰蛋白酶Trypsin、0.25%EDTA（Invitrogen公司），磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔生物化学制品），CCK-8试剂盒（日本同仁化学）。细胞培养箱Thermo、超净工作台BIOBSE、RT-1510酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司），流式细胞仪（美国BD FACSCalibur）。下瘀血汤：生大黄6g、桃仁6.7g、蟅虫11.6g，由南通市中医院中药制剂室煎制，浓度为每mL含生药量0.4g。

1.2方法

1.2.1大鼠含药血清制备：SD级大鼠10只随机分为对照组和服药组，服药组给药剂量[6-9]为1mL/100g体重，每天灌胃2次，对照组给予相同剂量的灭菌注射用水，连续3天。最后一次灌胃2h后，以3%戊巴比妥麻醉大鼠，心脏取血，分离血清，-20℃保存备用。使用前置56℃水浴锅灭活30min。

1.2.2CCK-8检测细胞增殖：将HepG2细胞按3 000个/孔种植于96孔细胞培养板中，贴壁后饥饿24h，加入不同浓度（0、10%、20%）含药血清培养，按照CCK-8试剂盒说明书检测各组细胞0h、24h、48h、72h时的 OD450值。

1.2.3凋亡实验：将HepG2接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度（0、10%、20%）含药血清，培养48h，收集上清死细胞及贴壁细胞，根据试剂盒说明书依次向3组细胞中加入PE Annexin V和7-AAD试剂，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4周期实验：HepG2细胞经各浓度含药血清孵育72h后，收集于4℃预冷的70%乙醇，置入-20℃冰箱过夜处理。第2天加入染色剂（40×PI母液、100×RNase母液、1×PBS），上流式仪检测。

1.2.5qRT-PCR检测NuSAP1表达：使用Trizol按照说明书步骤提取经过不同浓度含药血清处理72h的HepG2细胞的RNA，随后用Y Applied Biosystems GeneAmp 9700 PCR 系统（37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，5 min）行逆转录，最后通过SYBR Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒行荧光定量PCR（CFX Connect Real-time System）检测NuSAP1基因mRNA的表达量。通过Power=2-△△CT值计算相对表达量，随后采用Power值行统计学分析。引物序列如下：β-actin:Forward 5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′；Reverse 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′；NuSAP1：Forward 5′-TCATTTCCTTTTCTTGCCTCA-3，Reverse5′-CCCTCAAGTACAGTGACCTGC-3′。

1.2.6Western-blot检测 NuSAP 1表达：收集HepG2细胞，加入含cocktail蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液充分裂解后，离心取得蛋白。BCA法测定蛋白含量，以缓冲液将蛋白稀释至浓度5～10 μg/μL。依据说明书配置分离胶、积层胶，凝固后上样，80V恒定电压下电泳30min，140V恒定电压下电泳1h；制备夹层“三明治”，电压100V，转膜90min。丽春红染液显示蛋白条带，将目的蛋白剪下，晾干备用。常温下封闭液封闭膜2h后，加Nusap1抗体（Nusap1抗体6μL按1∶2 000双蒸水配制12mL），置于4℃冰箱过夜。第2天再加入HRP标记的2抗（兔2抗3μL 加双蒸水 12mL，1∶4 000），在暗室内化学发光、显影、定影，胶片晾干。

1.3统计学处理应用GraphPad Prism5统计学软件进行数据处理分析，计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA统计方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1含药血清抑制HepG2细胞增殖通过CCK-8实验检测含药血清对HepG2细胞增殖的影响，结果显示与对照组相比，不同浓度的含药血清能够明显抑制HepG2细胞的增殖，这一抑制作用在加入含药血清48h开始出现，72h更为明显。我们发现在48h时，10%及20%含药血清孵育的HepG2细胞与对照组比较，其OD值明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05），而在72h时这一抑制作用更为明显（P＜0.01）；同时含药血清抑制HepG2细胞增殖具有浓度依赖性，表现为20%较10%含药血清对HepG2细胞的抑制作用更明显（P＜0.01）。见图1。

图1　下瘀血汤含药血清抑制Hep-G2细胞增殖

2.2含药血清对HepG2细胞周期的影响通过流式细胞技术检测细胞周期，结果显示与对照组比较，不同浓度的含药血清对HepG2细胞周期起到阻滞作用，主要表现为将细胞阻滞于S及G2期。分别统计各组细胞的S期细胞所占比例，结果显示10%含药血清（P＜0.05）及 20%含药血清（P＜0.01）组 S期细胞较对照组明显增加，差异有统计学意义；紧接着我们分析各组G2期细胞的比例，结果发现10%（P＜0.05）和 20%（P＜0.01）含药血清组 G2期细胞比例较对照组明显增加，差异均具有统计学意义。随后我们分别统计各组细胞中处于S+G2期细胞所占比例，结果同样显示10%与20%含药血清处于S+G2期细胞较对照组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01），而更为重要的是我们发现20%含药血清组将HepG2细胞阻滞于S+G2期的能力较10%含药血清组更为明显（P＜0.01），揭示含药血清对细胞周期的阻滞作用具有浓度依赖性。见图2，表1。

图2　下瘀血汤含药血清阻滞Hep-G2细胞周期流式图

表1　下瘀血汤含药血清阻滞Hep-G2细胞周期流式细胞仪检测结果　%

2.3含药血清对Hep-G2细胞凋亡的影响与对照组比较，10%和20%含药血清对HepG2细胞系早期和晚期凋亡都有促进作用，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。我们还发现，20%含药血清较10%含药血清对HepG2细胞总体凋亡（早期+晚期）的促进作用更为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3、表2。

图3　下瘀血汤含药血清促进Hep-G2细胞凋亡流式图

2.4含药血清抑制NuSAP1基因表达我们通过qRT-PCR检测NuSAP1基因mRNA的表达情况，结果显示，与对照组比较，10%和20%含药血清组NuSAP1基因的mRNA表达较对照组比较明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；同样进一步分析发现，这一现象具有浓度依赖性，表现为20%含药血清组NuSAP1基因mRNA表达水平较10%含药血清组下降更为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。随后我们通过Western-blot检测含药血清对细胞表达NuSAP1蛋白的影响，结果显示，10%和20%含药血清均明显抑制NuSAP1蛋白的表达（P＜0.05），且随着含药血清浓度的增加，抑制作用更为明显（P＜0.05）。见图 4，图 5。

图4　PCR检测下瘀血汤含药血清抑制NuSAP 1表达

图5　Western-blot检测下瘀血汤含药血清抑制NuSAP1蛋白水平表达

3　讨　论

核仁纺锤体相关蛋白1（NuSAP1）是一种微管结合蛋白，在纺锤体中发挥重要作用，是调控细胞周期的重要分子。该蛋白水平在细胞增殖过程中逐步上升，在G2/M期到达高峰，随后出现下降，其过表达会致使细胞停滞在G1期，表达抑制则会导致纺锤体形成障碍，导致M期阻滞[10]，从而影响细胞增殖[11]。多项研究表明，NuSAP1基因在正常组织中几乎不表达，而在多种肿瘤细胞中过表达，明显高于非癌细胞[12-13]。抑制NuSAP1表达可以抑制肝癌的生长[14]。NuSAP1高表达与肝癌细胞的病理分化密切相关，并与肝癌的早期转移有关[15]。

下瘀血汤组方简单，大黄苦寒，性沉降，入血分，具有良好的活血逐瘀通经的功效，既清瘀热，又下淤血；桃仁味苦，善入心肝血分，善泄血滞，破血祛瘀力强；土鳖虫归肝经，咸寒入血，性善走窜，能破血逐瘀消积。现代研究证实大黄的有效成分大黄素对多种肿瘤细胞，如肝癌、宫颈癌、肠癌细胞具有杀伤和抑制作用，抗肿瘤作用明显[16-18]。现代研究表明桃仁具有抗凝血、抗血栓、增强免疫力、抗肿瘤等作用[19]。药理研究证实土鳖虫具有抗移码突变能力[20]，并能抑制人肝癌、胃癌细胞的呼吸[21]。

本研究结果发现，在含药血清孵育48h后，显示对肝癌细胞增殖的抑制作用，随着孵育时间延长和浓度增加，抑制肝癌细胞增殖的作用更明显，20%含药血清孵育72小时较10%含药血清具有更强抗肿瘤作用，其抑制作用与浓度、时间成一定的正比关系。含药血清对细胞早期凋亡和晚期凋亡均有促进作用，含药血清浓度越高促进凋亡的作用越明显。细胞周期实验显示，高浓度含药血清对肝癌细胞周期的抑制作用更明显。提示应坚持临床长期用药，适当浓煎，适度增加服药次数，以维持血液有效药物浓度，可更好发挥下瘀血汤的抗肿瘤作用。PCR、Western-blot实验结果显示，下瘀血汤具有良好抑制NuSAP1表达的作用，其抑制作用与含药血清浓度有关，20%含药血清的抑制作用更加明显。

综上所述，下瘀血汤对肝癌细胞具有良好的抗增殖、促进凋亡、抑制细胞周期的作用，此作用可能与其抑制NuSAP1表达相关。在今后的实验中，可进一步研究下瘀血汤抑制NuSAP1的信号通路以及与其他基因的关系。

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