血和尿钙卫蛋白、IL-18及血清肌酐对脓毒症小鼠并发急性肾损伤的早期诊断价值研究*

徐建如，曹丝雨薇 ，葛志华 ，黄海静 ，罗文明 ，韩　刚 ，刘　春 ，钱　骏 ，顾春燕

（1南通市第三人民医院急诊科，江苏226006；2四川大学华西药学院；3南通大学实验动物中心）

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，是导致急性肾损伤和多器官功能障碍或衰竭的常见原因。急性肾损伤（AKI）是影响脓毒症预后的独立危险因素。为了进一步了解钙卫蛋白和白介素-18（IL-18）等指标对脓毒症并发急性肾损伤的早期诊断价值，本实验构建了脓毒症小鼠模型，并且动态观察其血和尿钙卫蛋白、IL-18和血肌酐水平变化。

1　材料与方法

1.1构建脓毒症小鼠模型48只SPF级ICR小鼠，6周龄，雄性。由南通大学实验动物中心提供，均符合SPF级标准。实验动物生产许可证：SCXK（苏）2014-0001。将48只ICR雄性小鼠随机分成0h、6h、12h和24h亚组，每亚组12只小鼠。0h组为对照组，注射生理盐水，6只立即取血液样本，6只收集24 h尿液；其余3组小鼠均接受尾静脉注射细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），5mg/kg，分别于 6h、12h和24h时间点收集尿液并取血液样本和肾组织标本。

1.2实验室指标检测所有血清标本检测钙卫蛋白、IL-18和肌酐指标；尿标本检测钙卫蛋白和IL-18检测指标。钙卫蛋白和IL-18检测试剂由上海馨凝生物科技有限公司提供，实验方法为ELISA法，操作按说明书进行。肌酐检测试剂由日本Kyowa Medex Co.,Ltd提供，使用酶法由日立7600全自动生化分析仪检测。

1.3肾组织病理学变化常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色。根据肾小管内皮损伤判断肾脏损伤程度。

1.4统计学处理采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，使用 SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组血清钙卫蛋白、IL-18和Cr水平血钙卫蛋白、IL-18和肌酐在注射LPS后6小时开始上升，除血IL-18 P值为0.02外，其余各组均P＜0.001。提示血钙卫蛋白和IL-18与血肌酐相比较不能预测急性肾损伤。见表1。

表1　各组血清钙卫蛋白、IL-18和Cr等指标的检测水平

2.2各组尿钙卫蛋白和IL-18水平尿钙卫蛋白和IL-18在注射LPS后6小时开始上升，P均＜0.001。提示尿钙卫蛋白和IL-18能较好地预测急性肾损伤，尿钙卫蛋白更有优势。见表2。

表2　各组尿钙卫蛋白和IL-18指标的检测水平

图1　0h肾组织病理

图3　12h肾组织病理

图2　6h肾组织病理

图4　24h肾组织病理

2.3各组肾组织病理改变见图1～4。图1所见0h肾组织结构正常；图2所见6h肾小管上皮轻度改变，部分肾小管上皮细胞肿胀；图3所见12h肾小管上皮细胞肿胀、脱落，肾小管刷状缘损失，出现空泡变性；图4所见24h肾小管上皮细胞肿胀、脱落进一步明显，肾小管刷状缘损失，空泡变性严重，肾小管有堵塞。

3　讨　论

脓毒症是病原体侵袭机体，经由机体过度的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和氧化应激反应等，引起宿主免疫系统、炎症系统和凝血系统等多系统损伤，严重者可致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），乃至死亡。虽然脓毒症的发生机制和诊治策略均取得了一定的进展，但其发病率与死亡率仍居高不下，与脓毒症相关的病死率为30%～50%。急性肾损伤（AKI）是影响其预后的独立危险因素[1]，对脓毒症合并AKI患者，早期诊断和早期治疗对改善预后具有重要的临床意义[2-3]。目前AKI诊断标准存在一定的缺陷。急性透析质量委员会（ADQI）指出，SCr和尿量是目前AKI惟一可靠的检测指标。但是，SCr并非敏感的指标，受到其分布及排泌等综合因素的影响；尿量更容易受容量状态、药物等非肾脏因素影响。

钙卫蛋白是一种来源于中性粒细胞和巨噬细胞的含钙蛋白，其表达具有组织或细胞特异性，可作为急性炎性细胞活化的标志物。有研究表明，钙卫蛋白广泛分布于人体组织、体液及细胞中，是中性粒细胞、单核细胞和角质细胞的主要蛋白质。在炎症情况下，中性粒细胞及巨噬细胞在活化后可将其释放入血浆及体液中，因此钙卫蛋白被认为是一种炎症标志物。脓毒症时其水平明显增高[4-5]。在Heller等[6]的报道中，中段尿钙卫蛋白在肾性因素所致的AKI中明显增高，在肾前性所致的AKI中增高不明显。Slocum[7]认为中段尿检测钙卫蛋白对诊断AKI有应用前景。本实验结果显示：实验小鼠接受静脉注射脂多糖后，其血和尿钙卫蛋白水平在6小时开始上升，血钙卫蛋白在24小时，与对照组比较，差异才有统计学意义，而尿钙卫蛋白水平在6小时即呈明显上升，与对照组比较，差异有统计学意义，而且在24小时达最高水平，是同时间段血钙卫蛋白的3.68倍。血肌酐水平也在6小时开始上升，在12小时与对照组比较，差异才有统计学意义。而肾组织病理在6小时出现肾小管上皮的肿胀，12小时出现明显的肾小管上皮的改变，表现为上皮细胞肿胀、脱落，肾小管刷状缘损失，出现空泡变性，24小时肾小管上皮细胞肿胀、脱落进一步明显，肾小管刷状缘损失，空泡变性严重，肾小管有堵塞，比较三个实验结果，在肾小管上皮细胞发生肿胀时，尿钙卫蛋白即能检测。提示尿钙卫蛋白能较早地预测AKI发生。白介素 18（Interlukin 18，IL-18）是一种分子量为 18.0 kD的促炎性细胞因子。AKI后IL-18由近端肾小管产生，然后被含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1裂解并出现在尿液中。早期研究发现，IL-18可以用于AKI早期预测和诊断，并可预测AKI死亡率及预后[8]。动物实验证明IL-18在缺血性急性肾损伤发生后可很快在尿中被检测到。在临床研究中有两种不同的观点，（1）尿IL-18检测可以预测移植肾术后3个月功能恢复情况，对其持积极肯定的态度。（2）Haase等[9]针对成年心脏手术患者的前瞻性观察性队列研究结果显示，患者在进入ICU时和术后24h时两个时间点，AKI组与没有进展为AKI组相比较，两组患者的尿IL-18水平差异无统计学意义，认为在心脏外科术后早期的尿IL-18检测对于识别AKI患者并没有明显的价值。国内研究报道尿IL-18检测对急性肾损伤的早期诊断有较高的敏感性和特异性[10-11]。在最新的研究中，Parikh等[12]通过对重症监护病房（ICU)）中AKI患者进行前瞻性研究，检测尿IL-18水平是可以用于早期诊断AKI，其结论为尿IL-18水平不仅可以作为危重患者发生ARF的有效诊断指标，并且可以有效地预测其病死率。我们的小鼠模型实验结果显示：小鼠接受静脉注射脂多糖后，血和尿IL-18检测水平在6小时开始上升，血IL-18在24小时与对照组比较，差异有统计学意义，其结果并不优于血肌酐；而尿IL-18水平在12小时即明显上升，与对照组比较，差异具有统计学意义，提示尿IL-18检测能较好地预测脓毒症并发AKI。

总之，我们发现在脓毒症小鼠，血钙卫蛋白和IL-18水平虽有增高，但不能较好地预测脓毒症并发AKI；尿钙卫蛋白和IL-18能较好地预测脓毒症并发AKI，尿钙卫蛋白检测对早期预测脓毒症并发AKI更有优势，故尿钙卫蛋白检测具有较早的临床预测价值，其敏感性和特异性均优于传统的SCr等生物学指标。目前，我们的实验结果还仅限于实验室和动物实验中，需要进行大规模的临床验证，再做进一步的临床推广工作。

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