活体成像技术观察胶质瘤荷瘤鼠中过表达SASH1基因的作用*

张思铭 ，马　超 ，胡樱子 ，尤正晨 ，陈　汉 ，巫荣华 ，杨　柳 ，刘　梅

（南通大学1杏林学院医学部；2医学院口腔系，江苏226001；3南通大学附属医院神经外科；4南通大学神经再生重点实验室）

基因SASH1（SAM and SH3 domain containing 1） 属于 SLY（SH3-domain containing expressed in lymphocytes）家族成员[1]，拥有 SAM（sterile α module，不育 α 基序）和 SH3（Src homology domain 3，Src同源结构域3）两个重要的结构域。SASH1基因编码分子量为137kDa的蛋白，基因全长279 746 bp，包含着21个内含子和22个外显子，存在4.4kb和7.5kb这两种mRNA转录产物，而这两者的区别仅仅是3’端的非编码区的长度，其中4.4kb广泛表达于各组织中，7.5kb转录产物则仅在脑组织表达[2]。

目前研究表明SASH1是一个肿瘤抑制基因。Zeller等[3]发现，乳腺癌患者以及乳腺癌细胞系中SASH1 mRNA表达明显减少，甚至完全消失，表明SASH1基因表达下调或许是因为基因的缺失造成。Gong等[4]研究发现，SASH1表达与一些关键的超声图像特征包括边缘毛刺征呈负相关，与淋巴结转移有关，SASH1表达减少与乳腺癌不良临床及影像学特征相关。在肺癌以及甲状腺癌中也发现SASH1表达水平降低，且SASH1表达与肿瘤大小有一定的关系[5]。He等[6]研究表明SASH1在肝癌中具有显著作用，过表达SASH1可让shh信号通路失活，从而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。SASH1在卵巢癌[7]、宫颈癌[8]中表达显著降低或缺失。SASH1可以通过调节肺癌细胞的粘附以及迁移行为和促进细胞与基质的粘附[9]，Zhou 等[10]发现，SASH1 可以通过 Gα s-SASH1-IQGAP1-E-Cadherin转导途径调控黑色素细胞的跨膜迁移，是调控黑色素细胞侵袭的GPCR信号与钙调蛋白信号间的一种新的交流方式。然而SASH1在脑胶质瘤中作用还有待进一步研究。

脑胶质瘤大约占中枢神经系统肿瘤的1/2[11]，目前治疗仍以手术切除后辅助放化疗为主，但总体效果仍不理想。因为胶质瘤手术难以彻底清除，而且瘤细胞生长迅速、复发率高，患者生存期短、死亡率高[12]，是目前神经系统恶性肿瘤治疗的一个难点。

我们课题组前期研究表明，SASH1在胶质瘤组织中表达较癌旁组织显著减少，随着胶质瘤级别升高SASH1表达降低，表达程度与患者预后正相关[13]；我们尝试在人胶质瘤细胞U251中重新表达SASH1基因，发现肿瘤细胞增殖和侵袭能力显著降低，细胞凋亡明显增加[14]。然而在动物体内胶质瘤中过表达SASH1水平能否得到相似的结果，是基因治疗的关键基础数据。因此，本研究建立裸鼠荷胶质瘤模型，瘤内注射过表达SASH1病毒，通过活体生物发光成像技术[15-17]，实时观察裸鼠肿瘤荧光强度，研究SASH1基因表达对裸鼠胶质瘤生长的作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂和仪器：DMEM高糖基础培养基（Corning公司）；胎牛血清FBS（Sigma公司）；0.01mol/L PBS、0.25%Trypsin-EDTA（Gibco公司）；D-Luciferin，Potassium Salt/D-荧光素钾盐（上海翊圣公司）；ADV4-NC、ADV4-SASH1腺病毒（苏州吉玛公司）；CO2细胞培养箱（Napco公司）；荧光倒置相差显微镜、荧光正置相差显微镜（Leica公司）；低温高速离心机（Beckman公司）；37℃恒温水浴锅（Pharmacia公司）；图像分析系统（Leica公司）；超净工作台（SW-CJ-1F，苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司）；D-Luciferin，Potassium Salt/D-荧光素钾盐（上海翊圣生物科技有限公司），活体成像仪IVIS Lumina II（Caliper公司）。

1.1.2 实验动物：裸鼠BALB/c nu/nu，4～6周龄，体重20±2g。饲养于南通大学实验动物中心屏障系统，SPF鼠颗粒饲料（南通大学实验动物中心，小鼠饲料的配制标准及营养要求符合国家标准），饮用水为灭菌水，由饮水瓶自由摄取。

1.2方法

1.2.1稳定表达荧光素酶基因Luci的SHG-44细胞株的复苏、培养和扩增：取冻存于液氮中的稳定表达荧光素酶基因Luci的SHG-44细胞（本课题组构建，稳定表达 LV5（EF-1aF/GFP&Puro)-Luci），于37℃水浴快速复苏，加入完全培养液（含10%胎牛血清的DMEM，1%双抗）中，37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中培养。次日去除未贴壁的细胞，更换新鲜培养基，添加嘌呤霉素Puro至终浓度5μg/mL，维持GFP-Luci基因稳定表达的筛选压力，表达效率达95%以上，常规培养，2天换液，待细胞密度为80%～90%，按照1∶3比例传代，培养在100mm培养皿中，以获得对数生长期细胞用于裸鼠接种。

细胞接种前，细胞用胰酶消化1～2 min，加入完全培养基终止消化，1 000r/min离心3min弃去上清液，生理盐水洗涤2次，细胞计数，将细胞沉淀重悬于生理盐水中，将细胞密度调整为2×106/mL，进行皮下异位接种胶质瘤实验。

1.2.2皮下异位接种肿瘤模型的建立：采用5%的水合氯醛，每只裸鼠剂量0.08mL，腹腔注射裸鼠体内。以0.1%安尔碘消毒液于背侧近左后肢处进行消毒，用1mL微量注射器抽取制备好的细胞悬液，于裸鼠背侧近左后肢处行皮下注射100μL，留针2min。待麻醉苏醒后，放回笼中，每日进行观察裸鼠和肿瘤生长情况。

1.2.3瘤内注射治疗基因病毒：接种后3周，裸鼠接种胶质瘤部位出现肉眼可见肿瘤组织，至28～35天瘤块较为明显，可以进行病毒注射。采用小鼠活体成像分析肿瘤的荧光强度，参考裸鼠体重和瘤体荧光强度将荷瘤鼠随机分为两组。同前述方法麻醉裸鼠，其中一组采用采用25μL的微量注射器在裸鼠瘤体内注射 15μL的 ADV4-SASH1病毒（1×108TU/mL），对照组注射相同剂量的ADV4-NC对照病毒（1×108TU/mL）。

1.2.4小鼠活体成像分析（in vivo analysis in mice）：将DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钾盐溶液（15mg/mL），0.2μm滤膜过滤除菌（保持冰冷且避光保存）备用。小鼠麻醉后，按10μL/g体重的浓度向每只小鼠腹腔注射荧光素溶液，腹腔注射10～15 min后进行成像分析，对每只动物模型做荧光素动力学研究以确定峰值信号获取时间。每只裸鼠拍摄12～20 min，1分钟拍1次，共计拍摄12～20张。如麻醉深度不够或裸鼠提前苏醒或死亡，即终止活体成像，同时舍去该数据。计算荧光强度：每只裸鼠选取拍摄过程中每张图的最大荧光值（12～20个数值），去除1个最大值和1个最小值后，取平均荧光值作为评估该裸鼠体内肿瘤大小的指标。

1.3统计学处理数据用每组平均值±标准差进行表示。实验数据利用Graphpad Prism 5进行统计分析，将活体成像中获得的每一只裸鼠day 0的荧光数值标化为1，其相应的day 7的数值为注射病毒后肿瘤生长变化数值，对照病毒和SASH1基因病毒组数据进行单尾法异方差Student’s t检验，当P＜0.10时表示差异具有统计学意义。

2　结　果

2.1稳定表达GFP和荧光素酶基因的SHG-44细胞的培养扩增由本课题组建立的稳定表达GFP-荧光素酶基因的细胞系，保种于液氮，经复苏、对数生长培养扩增，在荧光显微镜下可以观察到细胞内均有GFP绿色荧光蛋白表达，即均表达荧光素酶基因，表达效率大于95%（见图1）。

图1　稳定表达GFP和荧光素酶基因的SHG-44细胞

2.2荷胶质瘤裸鼠模型的建立和观察在背部异位接种稳定表达GFP和荧光素酶基因的SHG-44细胞，如图3所示为裸鼠接种细胞后成瘤生长情况的示意图。注射1天后可见局部包块，无细胞悬液渗出及出血，大部分裸鼠在注射18～22天时可观察到注射处出现芝麻大小的结节；在25～30天后出现较为明显的肿块，呈分叶状、质实、边界清、活动度好、无液化显现；在接种后4周时计算成瘤率约为64%，表明荷胶质瘤裸鼠模型建立方法可行，可以进行后续病毒基因载体的干预治疗。

2.3荷瘤裸鼠瘤体中注射SASH1过表达腺病毒对异位胶质瘤生长的作用瘤体内注射治疗用病毒1周后，进行小动物活体成像，记录肿瘤的荧光强度，之后待小鼠麻醉苏醒后继续放回笼中。结果显示：对照组荷瘤裸鼠共计10只，71.4%裸鼠肿瘤荧光强度随着接种时间而升高，其中有30%的裸鼠在注射后养育过程的1周内发生死亡，20%裸鼠肿瘤荧光值有所下降，说明肿瘤生长良好，并造成部分裸鼠的死亡。与注射对照病毒组相比，注射ADV4-SASH1的荷瘤鼠共计12只，其中剔除2只（1只中途苏醒，1只注射麻药过量死亡），肿瘤荧光强度降低的占70%，表明注射过表达SASH1病毒可以较为明显地抑制肿瘤生长。对存活个体的肿瘤荧光强度进行统计，注射ADV4-SASH1的荷瘤鼠1周后肿瘤平均大小为注射前的90%，而对照组荷瘤鼠的肿瘤1周后显著增大至注射前的166%（图2）。

图2　SASH1过表达腺病毒对异位胶质瘤生长的影响

3　讨　论

目前活体成像技术已经在生物和医学等研究科学领域引起了广泛的关注，与之相关的活细胞标记技术也日趋发展[18-22]。自从Chalfie等[23]首次在大肠埃希菌和线虫中成功表达绿色荧光蛋白（GFP）之后，GFP逐渐成为应用最为广泛的标记性蛋白之一[22-26]。因此本研究进行裸鼠的异位接种时采用带有GFP标记的稳定表达荧光素酶基因Luci的SHG-44胶质瘤细胞系（LV5（EF-1aF/GFP&Puro）-Luci），其优点有：细胞培养过程中添加嘌呤霉素维持筛选压力下保持荧光素酶基因稳定表达不丢失，通过GFP标记方便在荧光倒置显微镜下观察基因的表达效率，理论表达效率为100%，通过拍照计算表达效率可达95%以上。

随着分子生物学的快速发展，寻找胶质瘤特异性的治疗靶点已成为临床研究的重要内容。本研究在课题组前期研究SASH1基因在体外培养的胶质瘤细胞中过表达作用的基础上，采用裸鼠成瘤，建立荷胶质瘤鼠模型，并通过瘤体内注射SASH1过表达腺病毒，初步探讨基因治疗的可行性。

我们采用活体成像技术测定荷瘤鼠中肿瘤的生长情况，可以对个体进行实时监测。为此我们通过裸鼠接种稳定表达带有荧光素酶基因的人胶质瘤细胞株，建立异位胶质瘤生长模型，在接种4周时计算裸鼠成瘤率约为64%。随后在肿瘤内注射构建的腺病毒载体过表达SASH1基因，于一周后进行动物活体成像观察。初步结果显示，与注射对照腺病毒相比，过表达SASH1基因可以显著抑制胶质瘤的生长。

综上所述，本研究在成功构建稳定表达荧光素酶基因的SHG-44胶质瘤细胞系基础上，利用该细胞系建立了裸小鼠皮下成瘤模型，采用在瘤体内注射腺病毒载体过表达SASH1基因，通过荧光活体观察了其对荷胶质瘤裸鼠体内胶质瘤生长的抑制作用。本研究为今后开展胶质瘤发生和发展机制的研究以及抗肿瘤基因药物的小鼠体内研究提供了实验方法。

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