PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果

常凤霞

（青海省第四人民医院检验科，青海 西宁 810000）

耐多药结核病是一种对利福平及异烟肼同时具有耐药性的结核病。此病属于结核病治疗中的重点及难点[1]。对耐多药结核病患者的病情及时进行诊断，并动态地监测其结核分枝杆菌的耐药性，是为其制定有效的抗结核化疗方案的关键[2]。目前，临床上对耐多药结核病患者结核分枝杆菌的耐药性进行监测的主要方法是进行结核分枝杆菌药敏试验。但是，进行结核分枝杆菌药敏试验较为费时，且存在标准化困难等缺点[2]。结核分枝杆菌耐药基因检测具有用时短、可有效缩短临床用药指导的时间等优势[3]。本次研究主要探讨PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象为2018年1月至2018年3月期间在青海省第四人民医院门诊或住院部接受治疗20例肺结核患者。

1.2 研究方法

使用PCR探针熔解曲线法对这20例患者体内结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素的耐药性进行耐药基因检测，方法是：1）采集患者3～5 mL的痰液作为检测标本。2）对检测标本进行痰结核分枝杆菌培养、鉴别及药敏试验，然后从中分离出20株结核分枝杆菌。另取30株野生型结核分枝杆菌（H37Rv标准菌株，由国家结核病研究所提供）。3）对这50株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药性进行耐药基因检测，方法是：⑴本次研究使用的试剂与仪器有PCR试剂[由生工生物工程（上海）有限公司生产]，结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药突变检测试剂盒（由厦门致善生物科技有限公司生产），PCR仪（由德国罗氏公司生产）。⑵对这50株待检结核分枝杆菌的菌株进行复活、接种及灭活，然后采用煮沸法提取菌株中的基因组DNA，并对其进行加样。⑶分别设立阴性DNA5 td和阳性对照品DNA5 td。对这50株菌株进行扩增后，使用PCR探针熔解曲线法检测其对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的基因突变情况。获取这50株菌株对上述四种抗结核药物的耐药情况。其中，使用利福平进行检测时菌株复合群rpoB基因在27个氨基酸密码子区域内存在的突变的情况；使用异烟肼进行检测时菌株ahpC启动子区、inhA94密码子区及inhA启动子区、katG315密码子区内存在突变的情况；使用乙胺丁醇进行检测时菌株在embB306、embB497、embB368、embB378、embB 380及embB406位密码子存在突变的情况；使用链霉素进行检测时菌株在rpsL基因43位密码子、基因88位密码子、TTS基因513～517位点及TTS基因905～908位点存在突变的情况。

1.3 观察指标

以药敏试验的结果为金标准，观察这20例患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素耐药表型的一致性。

2 结果

这20例患者体内结核分枝杆菌进行耐药基因检测的结果与利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药表型的一致性分别为：利福平为98%（49/50）、异烟肼为96%（48/50）、乙胺丁醇为62%（31/50）、链霉素为76%（38/50）。这些患者的结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼耐药表型的一致性较高，其结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与乙胺丁醇、链霉素耐药表型的一致性较低。

3 讨论

相关的研究发现，引起结核分枝杆菌发生耐药的分子机制与其存在基因突变有关。结核分枝杆菌发生不同的基因突变，会导致其对不同药物产生耐受性[2，4]。对耐多药肺结核患者体内结核分枝杆菌进行耐药基因检测具有以下优点：1）可快速地了解患者体内的结核分枝杆菌耐药基因的位点是否发生突变，有利于对患者的用药种类进行筛选。2）可在对患者进行动态的药学监测，及时了解其结核分枝杆菌菌株的耐药信息、耐药基因突变位点的变化，有利于准确地找到其体内结核分枝杆菌菌株产生耐药的原因，便于有针对性地为其调整治疗方案。3）可有效地阻断患者耐药结核分枝杆菌的传播途径，有助于控制其病情的进展[5]。有研究表明，PCR技术可以把扩增与检测合二为一，可实时进行扩增及检测，能够在同一时间检测结核分枝杆菌耐药的多个相关基因突变情况，具有高效、便捷等优点，尤其适用于临床上对大批量基因突变的结核分枝杆菌进行筛查[3，5]。本次研究的结果显示，这些患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼耐药表型的一致性较高，其体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与乙胺丁醇、链霉素耐药表型的一致性较低。此研究结果与胡春梅等[5]的研究结果相符。

综上所述，PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果显著，可迅速地筛查出患者体内结核分枝杆菌对利福平等常用一线抗结核药的耐药情况。