mazEF系统及生物膜对北京基因型结核分枝杆菌生存能力的影响

谢婉莹，赵继利，刘微，杨赛丽，袁俐

（石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室，新疆 石河子832000）

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）引起的结核病（Tuberculosis，TB）是世界范围内最常见的慢性感染性疾病之一。中国的TB 发病率在全球排名第二[1]，新疆是中国TB 发病较高的地区之一[2]。1995年，Van Soolingen 等在中国北京及周边地区首次发现了一个独立的遗传谱系，即MTB 北京基因型菌株，导致了全球三分之一的TB[3-4]。北京型结核菌株是中国主要流行菌株，也是新疆的主要流行菌株。与非北京型菌株相比，北京型MTB 具有一定的选择优势，传播速度更快，毒力更强，往往更加致命[5]。北京型菌株的这些特点被认为是内在相关特定分子的表达所致，究竟是哪些特定因子还不完全清楚。

毒素- 抗毒素系统（toxin-antitoxin system，TAS）广泛存在于许多细菌，包括MTB 菌株的染色体中。TAS 是由两个相互重叠的基因组成的一个操纵子，一个编码毒素，另一个编码抗毒素。毒素蛋白破坏产生它的细菌，抗毒素则阻止毒素的破坏作用[6]。mazEF系统是细菌中分布最广泛的毒素抗毒素系统，毒素mazF，化学性质是核糖核酸内切酶，切割mRNA 具有序列特异性。推测MTB 的mazF像大肠杆菌的一样，参与细菌的持留、程序性死亡、生物膜的形成以及对抗生素药物的耐受[7-8]。生物膜是一种由细菌自身产生的特殊结构，细菌在生长过程中，为了适应环境变化，分泌胞外多聚物将自身包裹其中，以逃避宿主的免疫反应和外界不良环境。大约80%的慢性炎症和感染性疾病都涉及到细菌生物膜，这类感染难以治疗[9]。来自对大肠杆菌的研究显示，生物膜的形成受数个TAS 的影响[10]。

本研究探索生物膜形成能力、mazEF3，6，9 系统的表达与北京型MTB 生存力的相关性。

1 材料与方法

1.1 菌株及鉴定

对照菌标准毒株结核分枝杆菌H37Rv 由北京结核与胸肿瘤研究所提供。北京型和非北京型MTB 菌株均从新疆结核病患者的痰液中分离得到，完成菌株鉴定及分型后，置石河子大学教育部重点实验室细菌室保存。本研究获得患者知情同意，并经石河子大学第一附属医院伦理委员会批准，在新疆地方病和民族疾病教育部重点实验室进行研究。

1.2 细菌培养

菌株接种在含有甘油和吐温80 的7H9 肉汤（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）中，在不同环境条件下培养，包括37 ℃的标准环境、缺氧和营养饥饿环境。将含有7H9 培养基的橡胶塞容器密封，培养细菌悬浮液，形成缺氧环境。用磷酸盐缓冲盐水作为培养基培养细菌，建立营养缺乏的培养环境。在所有被测试的不同培养环境中，空气：培养基体积比为1∶2。然后在不同时间点（2、4、6、8、10 d）检测浊度OD600，以判断细菌的生存力。

1.3 菌株生物膜形成能力的检测

取制备好的菌悬液在7H9 液体培养基中生长至对数期，调节其浊度OD600 值至0.4。将菌液接种于96 孔培养板中，每孔200 μL，用封口膜将接种过菌液的96 孔板进行密封后置于37℃恒温培养箱中培养15 d。用无菌吸管将培养板各孔中培养液吸去，室温静置30 min，向各孔中加入1%的结晶紫溶液200 μL，室温静置15 min，然后吸出结晶紫溶液，用蒸馏水洗板，重复洗板4 次，在吸水纸上拍干培养板，用酶标仪在570 nm 波长处测定光密度值。

1.4 菌株mazEF 基因扩增与测序

提取处于对数生长期的细菌总DNA。采用Primer 5.0软件设计mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6、mazF9引物。这些引物用于mazEF基因的扩增（表1）。

PCR 反应体系（20 μL 体系）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA 模板2 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反应条件：（1）mazE3、mazE6、mazE9、mazF3，mazF6 mazF9：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃1 min，退火52 ℃1 min，延伸72 ℃1 min，35 个循环，延伸72 ℃ 8 min。（2）mazEF3、mazEF6、mazEF9：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环，72 ℃延伸6 min。用1.5%琼脂糖凝胶，以0.5×TBE 为电泳缓冲液对PCR 反应产物进行电泳验证，将PCR 反应产物送上海生物工程有限公司进行测序。利用DNAMAN 软件将测序结果与标准株H37Rv 菌株进行比对。

表1 mazEF 基因的PCR 引物序列Tab.1 Sequences of mazEF primers for PCR

1.5 实时荧光定量PCR 检测MTBmazEF基因的mRNA 表达水平

使用RNeasy Plus Universal mini kit RNA 提取试剂盒提取对数生长的MTB 菌株总RNA。紫外分光光度法用于测定RNA 浓度和纯度，使用TianScript cDNA 合成试剂盒进行第一链cDNA 合成。将得到的cDNA 用紫外分光光度计检测RNA 浓度及纯度后，置cDNA 溶液于-80 ℃冰箱贮存。通过GeneBank 查找H37Rv 菌 株mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6、mazF9的基因序列，使用Primer 5.0 软件为mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6、mazF9和内参基因sigA设计特异性引物。这些引物用于实时定量聚合酶链反应（Quantitative real time-PCR，qRT-PCR）（表2）。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

表2 mazEF 基因的qRT-PCR 引物序列Tab.2 Sequences of mazEF primers for qRT-PCR

qRT-PCR 反应体系为20 μL，其中SYBR Select Master Mix 10μL，cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 6 μL 补足体系。使用ABI 公司的7500Fast 荧光定量检测仪进行检测。qRT-PCR 反应条件：50 ℃2 min 激活SYBR 酶活性，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40 个循环。溶解曲线参数：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s。

对所有样本的每个基因均做3 个复孔，取其平均值，获得各样本的Ct 值。以sigA 的拷贝数作为校正基数，△Ct =［Ct（sample）］-［Ct（sigA）］，2-△ct 即为该样本目的基因相对于内参的表达量。△△Ct =［△Ct（test）］-［△Ct（control）］，2-△△ct 为实验组 相对于对照组目的基因的相对表达量。

1.6 MTB mazEF 系统蛋白水平的检测

将在L wenstein-Jensen培养基上呈对数增长的MTB 菌落制备成细菌悬液，然后在85 ℃下灭活30 分钟。离心后收集沉淀物，-80 ℃保存。采用Qproteome 细菌蛋白制备试剂盒提取细菌总蛋白。利用紫外分光光度计Nanodrop2000 检测蛋白的纯度及浓度，并将待检的蛋白调至相同浓度。样品经SDS-PAGE 凝胶电泳 （5%浓缩胶和12%分离胶）分离，以GAPDH 作为内参蛋白，使用Western blotting技术检测其蛋白表达水平。GAPDH 单克隆抗体的稀释率为1∶10000。利用Image Lab 和Photoshop 软件对目标蛋白和对照蛋白条带进行灰度值测定。计算目的蛋白灰度值与其面积的乘积，以及内参蛋白灰度值与其面积的乘积，两者之比即为目的基因相对内参基因的蛋白表达量。

1.7 统计学分析

实验结果运用SPSS20.0 软件进行统计学分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义，P＜0.01 为差异具有显著的统计学意义。

2 结果

2.1 在不同环境下培养，不同菌株呈现出明显差异的生存力

在3 种不同的条件下（标准环境、缺氧和营养饥饿环境）：在不同时间点的培养（2、4、6、8、10 d），无论是H37Rv，还是北京、非北京基因菌株均显示在标准条件下的生长速度快于缺氧条件和营养饥饿环境，差异有显著性（P＜0.05）；北京型菌株生长速度快于H37R、非北京型菌株，差异有显著性（P＜0.05、P＜0.01）；非北京型菌株生长速度低于H37Rv，差异有显著性（P＜0.05）。

2.2 不同菌株呈现出明显差异的生物膜形成能力

图1 北京、非北京基因菌株和H37Rv 的生物膜形成能力Fig.1 The biofilm formation of Beijing，non-Beijing genotype strains and H37Rv

采用酶标仪测定了不同菌株在570 nm 波长下的生物膜形成情况。检测结果显示：北京基因型菌株的生物成膜能力大于非北京型菌株，差异有显著性（P＜0.01）；非北京型菌株的生物成膜能力低于H37Rv，差异有显著性（P＜0.05）（图1）。

2.3 菌株mazEF3，6，9 系统扩增与测序结果

2.3.1 目的基因的扩增结果

以H37Rv 的DNA 为模板，用表1中的引物，进行PCR扩增目的基因mazEF3、mazEF6、mazEF9、mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6和mazF9。再 用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证目的基因片段长度，9 个目的基因片段长度分别为632、587、571、321、249、231、312、345、357 bp，结果见图2。将PCR 产物送至上海生工公司测序，利用DNAMAN 软件将测序结果与GenBank 上H37Rv 的目的基因序列进行比对，同源性为100%，表明引物特异性良好。

提取北京、非北京基因型菌株的DNA 作为模板，用已验证的H37RvmazEF3 6 9的引物，进行PCR 反应，扩增目的基因，以验证菌株基因组中mazEF系统的存在。各菌株目的基因扩增条带大小与H37Rv 一致，均为mazEF系统存在株（图3a）；用已 验 证 的H37RvmazE3、mazE6、mazE9、mazF3、maz F6、mazF9的引物扩增目的基因，结果均扩增出相应的基因片段（图3b、c）。

图2 H37Rv 菌株的mazEF、mazE 和mazF 基因的PCR 扩增Fig.2 PCR amplification of mazEF，mazE and mazF genes in H37Rv strain

图3 PCR 检测不同MTB 菌株mazEF 体系的特性Fig.3 Characterization of mazEF systems in the different MTB strains by PCR

2.3.2 目的基因测序结果

将北京、非北京基因型菌株的目的基因mazE3、mazE6、mazE9、mazF3、mazF6、mazF9PCR 产物送至上海生工公司测序，由于3 个mazEF基因是由各自的mazE和mazF基因组成，且中间有碱基重合，因此不需测序。利用DNAMAN 软件将测序结果与H37Rv 相应的目的基因序列进行比对。

北京、非北京基因型菌株mazE3、mazE6、mazE9、mazF6、mazF9的测序结果与H37Rv 相应的目的基因序列同源性为100%；但是与H37Rv 相比，mazF3基因第193 位碱基均有突变，即在图4中193 处由碱基C 变为T，密码子由ACC 变为了ATC。查阅氨基

酸密码子表后发现，编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸。

图4 mazF3 基因的测序结果Fig.4 The sequencing result of mazF3 gene

2.4 菌株mazEF3，6，9 基因mRNA 水平的检测结果

与H37Rv 相比，北京基因型菌株mazEF6低表达0.14 倍，mazEF9低表达0.43 倍，差异有统计学意义（P＜0.05），虽然mazEF3高表达但无统计学意义（P＞0.05）；非北京基因型菌株mazEF6低表达0.09倍，mazEF9低表达0.29 倍（P＜0.01），虽然mazEF3低表达但无统计学意义（P＞0.05）；北京基因型菌株相对于非北京基因型菌株，mazEF3高表达9.55 倍（P＜0.05），但mazEF6和mazEF9高表达无统计学意义（P＞0.05）（图5a）。

与H37Rv 相比，北京基因型菌株mazE3低表达0.52 倍（P＜0.01），mazE6和mazE9低表达无统计学意义（P＞0.05）；非北京基因型菌株mazE3低表达0.59 倍，mazE6低 表 达0.47 倍，mazE9高 表 达5.04倍（P＜0.05）；北京基因型菌株相对于非北京基因型菌株mazE9低表达0.16 倍（P＜0.05），mazE3低表达和mazE6高表达无统计学意义（P＞0.05）（图5b）。

与H37Rv 相比，北京基因型菌株mazF3 高表达9.92 倍，mazF6高表 达7.25 倍，mazF9高表 达45.21倍（P＜0.05）；非北京/W 系菌株mazF3、mazF6、mazF9高表达均无统计学意义（P＞0.05）；北京/W 系菌株相对于非北京/W 系菌株，mazF3高表达4.86 倍，mazF6高 表 达2.64 倍，mazF9高 表 达5.37 倍（P＜0.01）（图5c）。

图5 用qRT-PCR 检测MTB 菌株MazEF3、6、9 基因mRNA 表达水平Fig.5 mRNA levels of MazEF3，6，9 genes in various MTB strains by q RT-PCR

2.5 MTBmazEF 系统蛋白水平的检测结果

提取H37Rv 以及北京、非北京基因菌株的蛋白，以GAPDH 作为内参蛋白，进行Western blotting实验检测其蛋白表达水平。MazF 蛋白抗体的合成由北京博尔迈公司完成，其中MazF3 和MazF6 抗体未能合成，因其制备过程中过表达质粒导入工程菌时，导致工程菌大量死亡，不能获得足量蛋白，推测MazF3 和MazF6 蛋白的毒性远远高于MazF9 蛋白。因此本实验只检测各实验菌株MazF9 的表达水平。结果显示，与H37Rv 相比，北京基因型菌株MazF9 蛋白高表达1.85 倍（P＜0.01），非北京基因型菌株MazF9 蛋白高表达1.22 倍（P＜0.05），北京基因型菌株相对于非北京基因型菌株，其MazF9 蛋白高表达1.62 倍（P＜0.01），差异均具有统计学意义，见图6。

图6 MazF9 蛋白在北京、非北京基因型菌株和H37Rv 中的表达Fig.6 MazF9 protein expression in Beijing，non-Beijing genotype strains and H37Rv

3 讨论

结核病是一种由MTB 引起的慢性传染病，已有几千年的历史。近30年来，随着艾滋病的流行、耐药菌株的出现和流动人口的增加，这种古老的疾病有再次出现的趋势，全球结核病形势急剧恶化。新疆的结核病疫情非常严重，北京基因型菌株是新疆地区MTB 的优势菌株[2，5]。研究结果显示在标准培养条件下MTB 的生长速度快于缺氧条件和营养饥饿环境。标准培养环境中，由于氧气充足且营养充分，适合MTB 生长繁殖；氧气缺乏环境中营养充分，MTB 生长轻度受限，这种不利环境也是促进MTB 持留生存的因素之一；营养饥饿环境中氧气充足，MTB生长速度最慢，繁殖频率降低以利于存活，也许这与MTB 入侵人体被巨噬细胞吞噬后不被清除变为休眠菌机制相一致。北京基因菌株生长速度明显快于H37R、非北京基因菌株，表明其生存能力强，对氧气缺乏、营养饥饿不利条件耐受性较好，这也许是北京基因菌株致病力强和使其成为主要流行株的原因之一。非北京型菌株与H37Rv 相比，其生长速度较慢，对不利条件耐受性也差，表明其生存能力差。

细菌生物膜是指细菌粘附于接触固体表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。生物膜内的细菌在形态结构、生理生化特性、对环境因素的敏感性等方面与浮游生物状态存在显著差异，导致其致病性、抗性显著增强[9]。由于生物膜的保护作用，生物膜中的细菌易于逃逸宿主免疫系统的清除，造成感染持续，对药物产生抗性[11]。早在120年前，已经发现MTB 可以形成生物膜，然而至今对MTB 生物膜的生理学与分子生物学机制还没有完全阐明[12]。实验结果显示北京基因型菌株和H37Rv 的生物成膜能力高于非北京基因型菌株，成膜能力的增大，势必导致其致病能力的增强，使其更容易传播、流行。非北京基因型菌株成膜能力较差，可能是其致病能力弱和流行受到一定限制的原因之一。

北京、非北京基因型菌株mazF3基因第193 位碱基有突变，由C 突变为T，使得密码子由ACC 变为了ATC。查阅氨基酸密码子表后发现，编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸，两种氨基酸都具有两个手性中心，四个立体异构体，但突变成的异亮氨酸作为支链氨基酸，推测其改变对蛋白质结构影响较大。但由于该突变在北京、非北京基因型菌株均存在，因此推测其不是导致北京基因型菌株易传播、流行的原因。由于课题组分离到的MTB 均具有这种突变，推测可能是MTB 在进化过程中为适应环境突变所致，该处突变也许对提高其致病能力或对宿主的亲和力具有一定的作用。

据报道，H37Rv 中mazEF3、mazEF6和mazEF9属于经典的毒素- 抗毒素系统，其中mazEF6、mazEF9在营养匮乏环境中启动子增强最显著[13]。H37Rv 菌株作为结核分枝杆菌标准株，具有较强的耐受力和生存能力，mazEF系统基因转录水平很高，特别是其mazEF6和mazEF9的高表达可以抵御不利环境、保证菌群存活。课题组的研究结果显示，在不同环境下培养菌株，H37Rv 菌株生长速度要慢于北京基因型菌株，推测原因除了北京基因型菌株比H37Rv 繁殖速度快以外，mazEF的表达可能还有一定阈值，过高的表达水平会限制细菌的生长甚至变为休眠菌。北京基因型菌株作为主要流行菌株比非流行菌株非北京基因型菌株的mazEF3基因转录要多，两者同为临床致病菌，推测mazEF3高表达也赋予了它高耐受性的特点，在入侵宿主时可以突破机体的免疫防线或介导免疫逃逸，这也许是造成其普遍流行、持留及耐药菌株出现的原因之一。

研究抗毒素基因mazE mRNA和毒素基因mazF mRNA表达水平显示，与H37Rv 相比，北京基因型菌株mazE3 低表达，与非北京基因型菌株相比，mazE9低表达；非北京基因型菌株与H37Rv 相比，mazE3、mazE6低表达，mazE9高表达。北京基因型菌株与H37Rv、非北京基因型相比，mazF3、mazF6、mazF9均高表达。mazE是编码抗毒素的基因，而mazF是编码毒素的基因，毒素破环产生它的细菌，而抗毒素抑制这种作用，mazE3、mazE6和mazE9可以抑制、消除对应的mazF3、mazF6和mazF9的作用。因此H37Rv转录更多的mazE以抵抗mazF的破坏作用，而北京、非北京基因型菌株转录的mazE则很少，且抗毒素不稳定，可被蛋白酶水解，最终导致毒素累积而使细菌死亡。贤一博等[14]报道，relA基因位于mazEF基因上游，可表达RelA 蛋白，其可调控氨基酸缺乏信号分子ppGpp 的表达，ppGpp 抑制mazE的表达，推测北京基因型菌株相对于H37Rv 菌株mazE3低表达，相对于非北京基因型菌株mazE9低表达，均可能在一定程度上受此通路的影响。诱导耻垢分枝杆菌过表达mazF3、mazF6和mazF9，该菌的生长受到抑制，而处于营养匮乏环境中，mazF6和mazF9，尤其是mazF9启动子活性较强[14]。作为临床主要流行株北京基因型菌株mazE9低表达，推测为是内在特定分子表达调节的结果，尤其是mazE9低表达和mazF9高表达的协同作用，能使更多的毒素累积进行利他性程序性死亡，从而提高自身对不良环境的耐受性，也许这也是其易传播的原因之一。北京基因型菌株作为世界主要流行菌株之一，致病力强，推测与其mazEF系统中毒素基因均高表达有关。

与H37Rv 相比，北京、非北京基因型菌株，MazF9 蛋白高表达，与mazF9基因mRNA 表达趋势一致。MazF 化学性质为核酸内切酶，切割单链mRNA，且具有序列特异性，MazF3 切割富含U 的区域，MazF6 切割UUCCU 序列，MazF9 切割UAC 序列，从而介导细菌的程序性细胞死亡。当细菌处于不良环境时，如营养饥饿、氧气缺乏等，细菌进入持留状态，从而达到自我保护性转变，mazEF系统的存在与激活是发生这种转变的因素之一。因此从个体水平上看，mazEF系统并不利于细菌的生长，但是从群体水平来看，mazEF系统有助于整个菌群的存活和稳定[14]。另外mazEF 系统可以介导MTB 生物膜的形成，而生物膜又可以大大增加MTB 耐受不良环境的能力，其中的内在联系及特定调节机制网络值得进一步探究。总之，转录水平mazF9基因的高表达、翻译水平MazF9 毒素蛋白的大量编码，也许是北京基因型菌株生存力强、易传播的原因之一。

本课题组2015年报道[15]：北京基因型菌株中38 kDa 和Ag85 的低表达，HspX 和Hsp65 的高 表达 与其生存力、毒力相关。本研究的结果也提示北京基因型菌株的mazEF 系统的差异表达、生物膜成膜能力强可能与北京基因型菌株生存能力强相关。