CD138蛋白在软组织肉瘤中的表达

张良，张鹏鹏，庞钰文，李真真，刘倩倩，商浩，王晓萌，李倩茹，刘春霞，李锋，2

（1 石河子大学医学院，新疆 石河子832002；2 首都医科大学附属北京朝阳医院病理科，北京100020）

CD138（SDC1/Syndecan-1）蛋白是Syndecan 家族中成员之一，在成熟组织中主要在上皮细胞表达，对促进上皮细胞与细胞外基质及与生长因子反应的相互作用占据着不可或缺的地位。在血液淋巴系统中，特异性的表达于前体B 细胞和浆细胞。同时其作为一种细胞表面蛋白多糖，在细胞增殖和分化以及细胞间粘附中发挥着重要作用。有研究表明，CD138 蛋白表达高低可能参与上皮细胞的恶性转化过程，与组织学分级和预后不良相关[1，2]。

CD138 蛋白在多种肿瘤中表达，但表达水平不一，在乳腺癌、卵巢癌和尿路上皮癌等肿瘤中高表达；但是在肝细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺浸润性导管癌和前列腺癌中却呈低表达。CD138 蛋白可作为多发性骨髓瘤诊断标准的一个重要指标[3]，也通常作为浆细胞分化标志物运用于未分化恶性肿瘤的诊断中。

近年来有学者发现，CD138 蛋白可表达于纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤[4]，同时研究表明在脂肪肉瘤中CD138 基因可调节脂肪形成，但相关文献报道还不多。因此，本研究旨在通过免疫组织化学来研究CD138 在软组织肉瘤中的表达情况，并运用癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析肉瘤患者无病生存率和总体生存率状况与CD138 基因表达高低之间的关系，为了解软组织肉瘤的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集1972-2016年石河子大学医学院附属第一医院病理科软组织肉瘤213 例，其中包括42 例平滑肌肉瘤，38 例隆突性皮肤纤维肉瘤，34 例未分化多形性肉瘤，31 例脂肪肉瘤，24 例横纹肌肉瘤，18 例尤文肉瘤，18 例纤维肉瘤和8 例上皮样肉瘤，同时收集到21 例正常脂肪组织。所有样本由多年从事软组织肿瘤病理诊断的高年资医师复诊，参与研究的所有患者均提供书面知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 制备组织芯片

核对选取的 8 种软组织肉瘤，在HE 切片上选出样本所需典型区域并圈记，同时在蜡块上相应区域标记为组织芯片构造位置，使用组织芯片制作仪（MiniCore，Mitogen 公司）构建组织芯片。

1.2.2 免疫组织化学染色及结果判读

CD138 蛋白在软组织肉瘤中的表达采用EnVision 二步法免疫组织化学染色进行检测，CD138一抗（鼠抗，Santa Cruz Biotechnology，USA）工作浓度1∶50，采用Ph6.0 枸橼酸煮沸15 min 进行抗原修复，一抗4℃冰箱孵育过夜，后续经过二抗孵育、DAB显色、水洗、中性树胶封片等步骤。浆细胞作为阳性内部对照，当不存在浆细胞时，使用人小肠组织切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲盐水作为空白对照。

结果判读采用双盲法：由两位高年资病理医师独立双盲阅片，结果取平均值。CD138 蛋白阳性表达于细胞膜和细胞质中，根据阳性细胞所占百分比分为：0 分（≤5%），1 分（6% -25%），2 分（26%-50%），3 分（51%-75%）和4 分（＞ 75%）；根据着色强度分为无着色0 分，弱黄色1 分，黄色2 分和棕黄色3 分；二者乘积来进行半定量评分。得分0或1 分为阴性组，2-4 分为+ 弱阳性组，5-12 分为2+ 强阳性组。结果使用阳性细胞所占百分比和着色强度的乘积作为阳性强弱的判断标准，来判断阳性强度。

1.3 CD138 基因表达与肉瘤患者预后的关系

为了解CD138 基因表达高低与肉瘤患者预后之间关系，我们使用基因表达谱分析交互式分析（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/）[5]网站进行分析TCGA 数据库中的数据，以此来了解CD138 基因表达与肉瘤患者之间的临床预后意义。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0 软件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）对实验数据进行统计学分析，使用Pearson’sχ2检验来分析各组CD138 表达统计学差异，P＜0.05定义为有统计学差异；使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software，CA，United States）作图。

2 结果

2.1 CD138蛋白在软组织肉瘤亚型中的表达

在八种软组织肉瘤中，CD138 蛋白呈现出不同程度的表达（染色结果总结见表1），CD138 蛋白在软组织肉瘤中，18.8%呈现1+ 弱阳性，12.2% 呈现2+ 强阳性。在8 种软组织肉瘤中，CD138 蛋白均有不同程度的着色，除了特异性的细胞膜染色，在细胞质中也出现着色。CD138 蛋白在横纹肌肉瘤中主要着色于细胞质和细胞膜（图1A）；在未分化多形性肉瘤主要着色于细胞质中（图1B）；在纤维肉瘤主要着色于细胞质中（图1C）；在隆突性皮肤纤维肉瘤主要着色于细胞质和细胞膜中（图1D）；在平滑肌肉瘤主要着色于细胞膜中（图1E）；在尤文氏肉瘤主要着色于细胞质（图1F）；在上皮样肉瘤主要着色于细胞质和细胞膜中（图1G）。进一步分析染色数据发现，当其中一种肉瘤与其他七种肉瘤相比时，脂肪肉瘤差异性高表达（χ2=30.01，P＜0.001）。

表1 CD138 蛋白在软组织肉瘤亚型中的表达Tab.1 Expression of CD138 protein in soft tissue sarcoma subtypes

图1 CD138 蛋白在软组织肉瘤和正常脂肪组织中的免疫组织化学染色（×200）Fig,1 Immunohistochemical staining of CD138 protein in soft tissue sarcoma and normal adipose tissue （×200）

2.2 CD138 蛋白在脂肪肉瘤各亚型中的表达

通过对脂肪肉瘤亚型染色分析，CD138 蛋白主要在去分化脂肪肉瘤中表达（图2A），在分化良好的脂肪肉瘤中阴性染色率为63.3%（9/14），而在去分化脂肪肉瘤中为5.9%（1/17）；2+ 阳性染色率在分化良好的脂肪肉瘤中为0，而在去分化脂肪肉瘤中为70.6%（12/17）。CD138 蛋白在分化良好的脂肪肉瘤中主要着色于细胞膜（图2B），而在去分化脂肪肉瘤主要着色于细胞质（图2C）。CD138 蛋白在正常脂肪组织中鲜有表达，阳性着色于细胞膜（图1H）。

与正常脂肪组织相比，CD138 蛋白在脂肪肉瘤中差异性高表达（χ2=12.668，P=0.002），提示CD138蛋白可能作为脂肪肉瘤的特异性标记物。与分化良好的脂肪肉瘤相比，CD138 蛋白在去分化脂肪肉瘤中显著性高表达（χ2=18.393，P＜0.001）。

图2 CD138 蛋白在脂肪肉瘤亚型中的免疫组织化学染色（×200）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD138 protein in liposarcoma subtypes （×200）

2.3 CD138 基因表达与肉瘤患者预后的关系

由于软组织肉瘤病例数少，本研究通过GEPIA生物信息学网站分析TCGA 数据库中肉瘤患者生存状况与CD138 基因表达高低之间的关系，结果图3显示不论是无病生存率还是总体生存率均与CD138基因表达无明显相关性（P＞0.05）。

图3 CD138 基因在肉瘤患者中的生存分析Fig.3 Survival analysis of CD138 gene in sarcoma patients

3 讨论

软组织肉瘤是一类间叶源性的恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的1%，儿童恶性肿瘤的15%，最常见的软组织肉瘤包括纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤[4，5]。虽然近年来分子生物学研究飞速发展，但软组织肉瘤病因机制仍未明了，遗传学及基因改变在肉瘤发病机制中发挥着很大的作用。MDM2 和p53 基因可作为软组织肉瘤独立的预后指标，N-myc、SAS 和CDK4 基因扩增也是软组织肉瘤所特有的指标，免疫组织化学已在软组织肉瘤诊断和治疗方面表现出了重要的价值。

CD138 蛋白是Syndecan 跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一员，作为一种细胞表面蛋白多糖通常参与细胞信号转导的激活。在诸多肿瘤中发挥着重要作用，其中包括细胞增殖和细胞间粘附作用，同时与肿瘤分期、分级存在相关性，表明其在肿瘤中重要的研究价值[6，7]。CD138 蛋白在上皮组织中广泛表达，而在前B 淋巴细胞和浆细胞上选择性表达，在乳腺癌、膀胱、卵巢、前列腺以及血液系统恶性肿瘤中参与肿瘤生物学进程作用研究广泛。恶性肿瘤的特征在于浸润和扩散，该过程的发展涵盖了细胞与细胞之间、细胞与胞外基质之间的粘附减少，肿瘤细胞通过细胞外基质或基底膜渗透扩散到血管、淋巴管或周围组织。该过程涉及包括CD138 这一因子，从而与肿瘤细胞生长和归巢转移相关。CD138 蛋白在许多恶性肿瘤中表达下调，引起细胞接触性抑制，增强肿瘤细胞增殖力，并促使其侵袭性缺失[8]。CD138 蛋白在乳腺癌细胞中表达下调，可抑制肿瘤细胞间与细胞外基质的粘附性，进而引起接触性抑制的缺失，增强增殖能力和侵袭性；这些过程都有可能与乳腺癌的侵袭和转移相关[9，10]。沉默CD138 基因表达可影响子宫内膜癌[11]和骨髓瘤[2]的细胞凋亡，提示CD138 基因在肿瘤中可能发挥着重要的作用。

CD138 蛋白在软组织肿瘤中也有少量报道，包括纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、尤文肉瘤、上皮样肉瘤和平滑肌肉瘤[12-17]。在一项对包括正常组织和各种良恶性上皮和间叶性肿瘤共1754 个样本的CD138 蛋白表达研究中，发现CD138 蛋白在正常组织和大多数上皮肿瘤中广泛表达，而在很少数的间叶性肿瘤中表现出弱膜或细胞质染色，包括尤文肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤及横纹肌肉瘤[12]。这与本研究中，尤文肉瘤16.7%（3/18）、纤维肉瘤16.7%（3/18）、横纹肌肉瘤8.3%（2/24）较少数的样本也表现出弱膜或细胞质染色的结果是一致的。先前研究发现在尤文肉瘤中，CD138蛋白可表现出强烈弥漫表达（100.0%，2/2）[13]、弱细胞膜或细胞质染色或者阴性[12]，与本研究11.1%（2/18）强阳性细胞膜和细胞质染色，72.2%（13/18）阴性表达的结果相符。研究显示，CD138 蛋白促进人纤维肉瘤细胞的增殖和转移能力[18]，提示CD138 基因可能在纤维肉瘤中可能扮演着促癌基因的角色，但在本实验组织样本中发现CD138 蛋白在纤维肉瘤中的表达率仅为27.8%（5/18），这可能与样本量有关。在上皮样肉瘤中，CD138 蛋白表现出细胞膜阳性（5/5）[16]，这与本实验结果37.5%（3/8）阳性表达有些出入。有研究报道称，软组织肉瘤骨转移样本CD138 蛋白高表达，并且与各种参与生长信号转导分子的表达相关。也有学者在小鼠白色脂肪组织中检测到CD138 mRNA 和蛋白质表达，这与本研究中正常脂肪组织的弱膜染色（14.3%，3/21）的结果是一致的。

当与其他七种软组织肉瘤相比时，脂肪肉瘤差异性高表达（χ2=30.01，P＜0.001）。与正常脂肪组织相比，CD138 蛋白在脂肪肉瘤中差异性高表达（χ2=12.668，P=0.002），提示CD138 蛋白可能作为脂肪肉瘤的特异性标记物。一项关于CD138 基因调节脂肪形成在脂肪肉瘤中的研究，通过免疫组织化学染色发现在分化良好的脂肪肉瘤中表现为阴性（0/6），在大多数去分化脂肪肉瘤病例（10/13）显示CD138 蛋白细胞质阳性染色：46%（6/13） 观察到弱染色（1+），而中等染色（2+） 到强染色为30%（4/13）；作者进一步在脂肪肉瘤两种亚型中运用实时定量PCR 检测CD138 基因表达，发现去分化脂肪肉瘤中CD138 mRNA 高于分化良好的脂肪肉瘤[19]。在本研究中，分化良好的脂肪肉瘤中仅55.6%（5/9）表现出了细胞膜弱染色（1+）；而大多数去分化脂肪肉瘤病例（16/17）显示CD138 蛋白的细胞质阳性染色，70.6%（12/17） 表现出强细胞质染色；两种亚型CD138 蛋白表达差异性具有统计学意义（χ2=18.393，P＜0.001）。脂肪肉瘤起源于脂肪细胞，目前国际分类中的三种脂肪组织肿瘤的分类是有区别的：（1）良性：主要是脂肪瘤；（2）中间性：分化良好的脂肪肉瘤（well-differentiated liposarcomas，WDLPS）；（3）恶性：去分化脂肪肉瘤（dedifferentiated liposarcomas，DDLPS），粘液样脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤。常规苏木素- 伊红（HE）染色并不能很好地诊断脂肪肉瘤，免疫组织化学的发展使得诊断精确度得以提高，但可用于诊断脂肪肉瘤的免疫组织化学标记物很少。超过40%DDLPS 可能会复发，标准化疗治愈率低，5年死亡率为30%，对新治疗靶点的需求十分迫切。因而，研究脂肪肉瘤的特定免疫组化标记物，将可能为鉴别脂肪肉瘤提供很好的帮助。

通过分析TCGA 数据库中肉瘤患者CD138 基因表达与生存状况之间的关系发现，虽然CD138 基因低表达患者生存与高表达患者生存之间无统计学差异，但我们仍然相信，只要数据量足够大，CD138低表达患者的生存率比高表达患者终会有相关性。

4 结论

CD138 蛋白在各型软组织肉瘤中均有不同程度表达，脂肪肉瘤组织中的表达与其组织学亚型相关，提示CD138 蛋白可能参与脂肪肉瘤肿瘤的发生发展。相信随着分子生物学和癌基因研究的不断发展，CD138 蛋白将对软组织肉瘤的预防、治疗和预后有全面深入了解。