脾多肽注射液中多肽成分的质谱分析

郭亚萍，范乐之，汪家利，张海燕，孙仁宽，王航宇，黄健2，*，王金辉，

（1 沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳110016；2 哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨150000；3 深圳弘汇生物医药有限公司，广东 深圳518118；4 石河子大学药学院，新疆 石河子832000）

脾多肽注射液是健康小牛脾脏提取物制成的分子质量小于 6000 的多肽、游离氨基酸、核酸、总糖的无菌水溶液。目前脾多肽注射液在临床上主要是联合其他药物治疗胰腺癌[1]、食管癌[2]、非小细胞肺癌[3,4]、卵巢上皮性癌[5,6]、原发性肝癌[7]、胃癌[8]、中晚期宫颈癌[9]、大肠癌[10]、直肠癌[11]、结肠癌[12]等；还可用于治疗恶性肿瘤化疗后引起的血小板减少[13,14]、纠正重度烧伤患者及肺癌患者肺部感染的T 淋巴细胞亚群紊乱[15,16]等。近年来，对脾多肽注射液联合其他药物治疗各种肿瘤研究备受关注，而对其中的多肽成分鉴定分析及其多肽裂解规律未见报道。本文基于对其他多肽的质谱裂解规律[17-21]的研究，根据已有的蛋白质组学数据和表达量丰度排名选择9种多肽作为研究对象。运用Analyst 1.6.2 软件中的Calculators 工具计算，得到各肽段加氢后带不同电荷的准分子离子；采用ChemBioDraw Ultra 14.0 软件模拟多肽肽段的裂解，得到各肽段的碎片离子；然后准分子离子和碎片离子组成离子对，优化源参数和化合物参数后进行MRM 扫描；再用合成的TD1进行Q1 和MS2 扫描结果和脾多肽注射液MRM 的结果比对，对其数据进行分析总结，推断其裂解规律。在脾多肽注射液现行标准基础上，本文首次利用质谱检测，为脾多肽注射液的后续研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器与药品

试剂：甲醇、乙腈和甲酸，均为色谱级；美国赛默飞世尔科技有限公司。

主要仪器：API 3000 串联三重四极杆质谱仪，美国AB SCIEX ；QL-866 涡流仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；SPE 柱，BAKERBOND Octadecyl C18，美国J.T.Baker ；MS 105 电子天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；纯水仪，英国ELGA PURELAB Classic。

药品：脾多肽注射液（2 mL/ 支，一盒6 支；吉林丰生制药有限公司），多肽EIAQDFKTDL（TD1）（纯度99.06 %，强耀生物科技有限公司）

1.2 实验方法

1.2.1 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI 源）；检测模式：正离子模式监测；扫描方式：多反应监测（MRM）（脾多肽注射液）、全扫描（Q1 Scan）（TD1）、产物离子扫描（Product Ion Scan （MS2））（TD1）；离子喷射电压（IS）：5.0 kV；温度（TEM）：0 ℃；雾化气（NEB）：5；气帘气（CUR）：8；碰撞气（CAD）：4（脾多肽注射液）、1（TD1） ；去簇电压（DP）：30 V（脾多肽注射液）、80 V（TD1）；聚焦电压（FP）：100 V（脾多肽注射液）、200 V（TD1）；入口电压（EP）：10.00 V；碰撞能（CE）：30 V；碰撞室出口电压（CXP）：15 V。

1.2.2 脾多肽注射液工作液的配制

先用2.0 mL 甲醇活化SPE 柱，待用。再取100 μL 脾多肽注射液于1.5 mL 离心管中，加入900 μL甲醇，涡流混匀后，移取至到SPE 柱上，用2.0 ml 甲醇洗脱至10.0 mL 容量瓶中，加入1.0 mL 1% 甲酸水，甲醇定容，混匀，即得脾多肽注射液的工作液。

1.2.3 多肽EIAQDFKTDL（TD1）工作液的配制

称取约1.0 mg（实际称样量：0.98 mg）TD1，用33%乙腈-67%水溶剂定容至5.0 mL 容量瓶，即得浓度为196 μg/mL 的储备液；用0.1%甲酸- 乙腈溶剂稀释至1.96 μg/mL，即得TD1 的工作液。

1.2.4 测定

脾多肽注射液：运用Analyst 1.6.2 软件中的Calculators 工具计算，得到各肽段加氢后带不同电荷的准分子离子；采用ChemBioDraw Ultra 14.0 软件模拟多肽肽段的裂解，得到各肽段的碎片离子；然后准分子离子和碎片离子组成离子对，优化源参数和化合物参数后进行MRM 扫描。

TD1：先进行Q1 scan 扫描，优化NEB、CUR 等源参数和DP 等化合物参数，找到响应最强的母离子比如590.6 [M+2H]2+；然后进行Product Ion Scan（MS2）扫描，优化CE 等化合物参数，找到目标子离子。

2 结果

2.1 脾多肽注射液MRM 结果分析

脾多肽注射液的MRM 结果见表1。以十个氨基酸的TD1 为例，a，b，c，x，y，z 型碎片离子结构如图1所示；9 种多肽均检测到4 种可能的多电荷准分子离子峰，而且都检测到a，b，c，x，y，z 型碎片离子。在4 种可能的多电荷准分子离子峰中，[M+2H]2+的碎片离子最多且大部分为小分子碎片离子；推测在低碰撞能的作用下，可能比较容易从多肽的两端裂解，而不易从多肽的中间裂解。

图1 TD1 的结构图Fig.1 The structure of TD1

表1 脾多肽注射液中9 种多肽对应的氨基酸序列、母离子及检测到的碎片离子Tab.1 Nine polypeptide of Lienal Polypeptide Injection corresponding Amino acid sequence ，Parent ion （m/z） and detected product ions

2.2 TD1 的MS 谱图分析

从图2可知，TD1 中检测到的准分子离子峰m/z分别为591.0（[M+2H]2+）和1180.4（[M+H]+），最强的准分子离子峰m/z 为591.0。

图2 TD1 的质谱图Fig.2 MS spectra of TD1

2.3 TD1 的MS/MS 谱图分析

从图3可知，在碰撞能为35 V 时，母离子m/z 393.7（[M+3H]3+）几乎被完全裂解，其特征碎片的离子峰少而且强度低，大部分为小分子碎片离子；母离子m/z 591.0（[M+2H]2+）的特征碎片离子峰多且强度较高；而母离子m/z 1180.1（[M+H]+）被裂解的很少，特征碎片离子峰少且强度低。以上结果表明，在相同碰撞能作用下，不同电荷的母离子，谱图差异很大；且母离子带的电荷越多，多肽越易被裂解，特征碎片离子越小。

图3 TD1 不同母离子在35 V 碰撞能作用下的质谱图Fig.3 MS spectra of different parent ions of TD1 at 35 V of collision energy

当碰撞能在20～35 V 时，TD1 母离子590.6（[M+2H]2+）的特征碎片离子峰为m/z 215.1，243.1，737.4，937.5 的强度随碰撞能的增加而改变（图4）。当碰撞能为30 V 时，母离子大部分被裂解，产生较多的特征碎片离子峰，且特征峰m/z 215.1 最强，最适合于对TD1 进行定性与定量分析。

图4 TD1 最强母离子590.6（[M+2H]2+）在不同碰撞能作用下的MS2 谱图Fig.4 MS2 spectra of 590.6 （[M+2H]2+）of TD1 at different collision energy

从图5可知，TD1 的最强准分子离子峰590.6（[M+2H]2+）在最优碰撞能条件下，主要产生b 型和y型碎片离子。从其碎片离子的响应强度来看，b2 和y8 碎片离子响应都强，推测TD1 中异亮氨酸羧基端易裂解；其次是b3 和y7 碎片离子，推测TD1 中谷氨酰胺氨基端易被裂解。

图5 TD1 在最优碰撞能作用下的MS2 谱图Fig.5 MS2 spectra of TD1 under the corresponding optimized collision energy

3 讨论

采用三重四级杆质谱技术可以对脾多肽注射液中的多肽成分进行分析，而且可对TD1 的准分子离子峰及其分布规律，研究其准分子离子峰的裂解规律；在电喷雾离子化过程中，脾多肽注射液中的多肽很容易带上多电荷，裂解时很容易产生小分子碎片离子，而且[M+2H]2+和[M+3H]3+母离子产生的碎片离子最多。

在TD1 的MS2 谱图中，在相同碰撞能作用下，不同电荷的母离子，谱图差异很大；且母离子带的电荷越多，多肽越易被裂解，特征碎片离子越小；当碰撞能在20～35 V 时，母离子590.6（[M+2H]2+）的特征碎片离子峰的强度随碰撞能的增加而改变；当碰撞能为30 V 时，母离子大部分被裂解，产生较多的特征碎片离子峰，且特征峰m/z 215.1 最强，最适合于对TD1 进行定性与定量分析；在最优碰撞能条件下，主要产生b 型和y 型碎片离子，根据碎片离子的响应强度，推测异亮氨酸羧基端和谷氨酰胺氨基端易被裂解。

综上，本研究运用三重四极杆质谱对脾多肽注射液中9 种多肽进行了定性分析，并以TD1 为例推测了其可能的裂解规律，为后续TD1 的定量研究提供理论依据；也为脾多肽中其他多肽成分的定性及定量研究提供了一种灵敏度高的方法。