四川省部分地区猪圆环病毒2型流行病学调查

2018-04-12李海全万青山四川省北川羌族自治县农业局四川绵阳6750四川省三台县农业局四川绵阳6750四川农业大学动物医学院四川成都60

养猪 2018年2期

李海全，万青山，王雪，王印（.四川省北川羌族自治县农业局，四川绵阳 6750；.四川省三台县农业局，四川绵阳 6750；.四川农业大学动物医学院，四川成都 60）

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是迄今为止发现的一种最小的脊椎动物病毒。圆环病毒1型（PCV1）无致病性，而圆环病毒2型（PCV2）具有致病性。圆环病毒2型在临床上主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、仔猪先天性震颤（CT）、坏死性间质性肺炎（PNP）、母猪繁殖障碍等疾病有关[1]。主要引起猪的多系统功能障碍性疾病，同时PCV2还主要侵害机体的免疫系统，造成猪的免疫抑制，导致了猪群的死亡率大幅增加。此病在世界各国已经普遍存在，并且在各大猪场中也已经蔓延，对全球的养猪业造成了很大的威胁和经济损失。

为研究PCV2在四川部分地区的流行情况，笔者于2015年10月5日至2017年3月14日对四川省成都市、遂宁市、绵阳市、雅安市、南充、乐山、蒲江等7个市县地区14个规模化猪场的181份样品进行了抗原检测。

1 试验试剂

蛋白酶K、SDS、Tris饱和酚、引物购自上海生工生物有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000购自大连TaKaRa生物工程有限公司；琼脂糖购自Biowest公司。试验过程中使用的其他试剂如氯仿、无水乙醇、异戊醇等均为国产的分析纯产品。

2 试验方法

2.1 临床观察和病理学观察

对采集的死猪和病料组织进行解剖以及病理变化的观察，并结合其临床特征，初步诊断患猪为圆环病毒2型感染，最终采用PCR技术对其进行检测，统计PCV2的阳性率。并在检测出的阳性样品中，讨论猪圆环病毒2型引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）以及猪皮炎肾病综合征（PDNS）的感染情况。

2.2 引物的设计和合成

根据GenBank上已发表的PCV2全基因组序列（AF027217），利用Premier express 5软件针对ORF2基因片段设计一对特异性引物：上游引物：5'-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3'，下游引物：5'-ACCC CCGCCACCGCTACC-3'。该引物稀释为 10 pmol/μL，在-20℃保存备用。

2.3 DNA的提取

将组织样本剪碎后放入研钵，加入少量PBS溶液，研磨成匀浆，反复冻融3次后收集于离心管中，7 000 r/min 离心 5 min 取上清液 500 μL，加入 25 μL的蛋白酶 K（20 mg/mL）和 75 μL 的 10%SDS，55 ℃水浴摇床上放置2 h后加入等量Tris饱和酚溶液，10 000 r/min离心10 min，取上清液并加等量的酚∶氯仿∶异戍醇（25∶24∶1）抽提 1 次，最后用两倍体积无水乙醇沉淀，晾干后加入30 μL蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。

2.4 PCV2特异性基因片段的扩增

反应体系为：Mix 12.5 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，双蒸水 7.5 μL，DNA模板3 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 45 s，62℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72℃总延伸10 min，反应结束后电泳。

2.5 电泳与结果判定

取5 μL PCR产物加入1.2%琼脂糖凝胶板加样孔中。同时取5 μL DNA Marker DL 2 000作为分子量参照物。接通电源，120 V电压电泳20 min。电泳结束后将1.2%琼脂糖凝胶用紫外凝胶成像仪进行观察，照相。在阳性对照和阴性对照都成立的条件下，如出现一条1 154 bp大小的目的条带即为阳性，否则判为阴性。

3 结果与分析

3.1 PCV2临床诊断结果

在本次试验调查获得的阳性样品中，大多数猪群在断奶后1周左右出现渐进性消瘦、生长迟缓、贫血和黄疸等症状，有的猪出现呼吸困难。剖检表现为全身淋巴结肿大，有的还出现肺脏水肿，脾脏肿大、坏死，肾脏衰竭等病理变化。在检测过程中，此病大多数感染刚断奶仔猪，致其死亡。由此可初步怀疑大部分猪场因感染PCV2而致PMWS。

其中绵阳市和遂宁市的6个规模化猪场中检测到PCV2感染所引起的皮炎和肾炎症状：皮肤表面有黑紫色凸起的烂斑；病理变化主要为猪全身淋巴结肿大，肾脏畸形，肿大呈土黄色，有的肾脏表面有出血点。由此可初步诊断这6个规模化猪场存在PCV2感染引起的猪皮炎肾病综合征（图1和图 2）。

图1 皮炎

图2 肾脏肿大

3.2 PCV2流行病学调查

本次试验从四川省遂宁市、绵阳市、成都市、南充市、雅安市等7个市县地区的14个规模化猪场共采集疑似圆环病毒2型感染的死猪、病料、精液、血样等样品181份，提取核酸采用PCR技术对其进行检测，检测结果详见表1和图3。在检测的181份样品中，共检测出阳性样品89份，得出PCV2阳性率为49.2%。且这14个规模化猪场中均检测出了PCV2阳性。在死亡的43头死猪中，有21头份检测出了PCV2。病料中的阳性检出率最高，为54.0%。

表1 样品PCV2的检测结果

3.3 不同病料中检出PCV2的阳性率

在检测的21头PCV2阳性死猪中，分别对其腹股沟淋巴结、脾脏、肝脏、肺脏和肾脏组织处理后，提取核酸，PCR扩增检测及统计阳性率，结果见表2。根据表2结果可以看出，在检测的21头PCV2阳性死猪中，腹股沟淋巴结的阳性率高达100%，脾脏的阳性率也在90%以上。肺脏和肾脏的阳性率也相对较高，均在80%以上。肝脏的阳性率相对较低，只有66.7%。

表2 21头PCV2阳性死猪不同病料中PCV2的阳性率

3.4 PCV2阳性率随季节的变化

采用PCR技术对不同季节采集的疑似圆环病毒2型感染的样品进行PCV2检测，具体结果见表3。结果显示，在春季检测数较多，检出PCV2阳性率也较高，为51.4%；夏季阳性率为最高，达62.5%；秋季阳性率为48.8%；冬季阳性率最低，只有38.1%。

表3 不同季节PCV2的阳性率

4 讨论

4.1 PCV2在四川地区的流行情况

本研究调查该病在四川部分地区的感染率为49.2%。2013—2015年全国20个检测单位的报告统计结果表明，全国PCV2感染的平均阳性率达55.04%[2]。从调查数据可以看出，四川省PCV2的阳性率比早期全国PCV2感染的平均阳性率低，说明四川部分地区的规模化猪场采取了相应的措施防控PCV2的感染，例如接种疫苗、加强饲养管理等，但效果仍不理想。与已报道的北京、河北、山东等省市比较，四川省PCV2的阳性率仍然较高，从而致使患猪免疫力降低，给其他病原入侵提供了机会，大幅增加了猪的死亡率。因此，各猪场还需结合各自具体情况制定更加全面的防控措施。

4.2 不同组织PCV2检出结果

在检测的21头阳性死猪中，又分别对腹股沟淋巴结、脾脏、肾脏、肺脏和肝脏进行了PCV2检测，根据表2可以看出，腹股沟淋巴结和脾脏检出的阳性率特别高，尤其是腹股沟淋巴结高达100%，这主要与PCV2侵害机体的免疫系统、造成猪的免疫抑制有关。病毒可在免疫器官大量繁殖，进而引起机体免疫淋巴细胞破坏，这为免疫器官是PCV2复制的主要场所提供了依据。李焕荣等[3]研究表明PRRSV和PCV2能相互影响，使猪肺巨噬细胞免疫调节功能较长时间处于失控状态，影响了机体免疫应答的有效发挥和对病毒的有效清除，所以在肺脏的检出阳性率也高达80%以上。而肾脏的较高检出率可能是与猪圆环病毒2型所引起的猪皮炎肾病综合征有关。

4.3 季节与猪群PCV2阳性率的关系

本试验针对四川省部分地区规模化猪场不同季节感染PCV2的情况作了调查统计，从表3检测结果可以看出，四川省近年来春夏季节圆环病毒2型感染数量最多，且夏季PCV2阳性感染率最高，说明在春夏季节四川省部分地区的规模化猪场易感染PCV2。这符合已有报道[4]，PCV2的阳性感染率在春夏季节高于秋冬季节[5]。此结果可能与四川省夏季高湿闷热、昼夜温差变化较大有关，而很多猪场在此期间不能很好地做好猪舍的饲养管理工作，猪群因高湿高热产生应激，导致猪群免疫力下降，患病率和死亡率也相应增高。

4.4 混合感染

本研究表明，近年来PCV2已经在四川省部分规模化猪场中广泛流行，而且猪群中PCV2阳性率有上升的趋势，病毒的混合感染与继发的细菌感染情况也较为严重，这也是导致猪群死亡率大幅增加的重要原因。在此次猪圆环病毒2型抗原PCR检测的同时，还做了其他一些病毒和细菌的检测，发现与猪圆环病毒2型混合感染的主要病毒为猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒；而继发的细菌感染多数为副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌以及放线杆菌等。说明目前生产实践中猪圆环病毒2型病并不是单一发病[6]，这些混合感染导致猪群死亡率增高。因此各猪场应该从免疫检疫、饲养管理等方面防止圆环病毒2型感染的发生，减少猪只应激，控制继发感染，尽早处理病畜，采取严格的生物安全措施以降低损失。