蛋白质水解物在动物营养中的作用

侯永清，武振龙，王根虎，

戴兆来 2，　伍国耀 1，2，4＊

（1.动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，武汉轻工大学，湖北武汉，430023；2.动物营养学国家重点实验室，中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.上海亘泰实业集团，上海，201015；4.美国得克萨斯农工大学动物科学系，美国大学城，77843）

蛋白质是一种大分子物质，通常由二十种不同的氨基酸通过肽键连接组成。蛋白质是动物组织（如骨骼肌、乳腺、肝脏和小肠）和畜产品（如肉、牛奶、鸡蛋和羊毛）的重要组成成分。例如，生长期肉牛和育肥猪骨骼肌中的蛋白质含量约占干物质总量的70%（Wu等，2016）。因此，摄入充足的蛋白质对家畜、家禽和鱼类发挥最大生长、生产性能和饲料效率都是必不可少的。Wu（2013）报道，饲料中的蛋白质（如血粉、肉、骨粉、肠黏膜粉、豆粕、花生粕、棉籽粕）在小肠中蛋白酶的作用下被水解成小肽（二肽、三肽）和游离氨基酸。水解生成小肽的类型与动物生理状况和日粮组成密切相关。动物和植物性蛋白质饲料在被采食前通过化学处理、酶或者微生物发酵，可改善其营养品质、降低抗营养因子的含量并产生肽类 （Dieterich等，2014；Pasupuleki等，2010）。 此外，酶解和微生物发酵可以提高动物和植物性蛋白质饲料中小肽的溶解度、黏度、乳化性和凝胶化程度。

不同来源（细菌、植物和酵母）的蛋白酶均可用来酶解动物和植物性蛋白质饲料，多种微生物通过发酵，将动物或植物性蛋白质饲料水解生成肽类。目前，蛋白质水解物已广泛应用于医学、营养（包括动物营养）和生物技术领域 （Pasupuleki等，2010）。本文主要对通过酶解技术和微生物发酵技术生成蛋白质水解物的相关研究进行综述，并对其在动物饲养中营养及生理学功能进行探讨。

1　氨基酸、肽和蛋白质的定义

氨基酸是含有氨基和酸基基团的有机物。除甘氨酸外，所有蛋白源氨基酸均有一个α-氨基，并可在动物体内和饲料中形成L-异构体。肽被定义为由2个或2个以上氨基酸残基通过肽键连接成的有机分子（Wu，2013），每形成一个肽键脱去一分子水。寡肽由2～20个氨基酸残基组成。含有小于或等于10个氨基酸残基的寡肽称作小寡肽（或简单的小肽），而含有10～20个氨基酸残基的寡肽称为大寡肽。Kyte（2006）认为，超过20个氨基酸残基组成的肽被称为多肽。蛋白质是一种高分子量的多肽，通过肽键将相邻氨基酸分子的α-氨基和α-羧基连接。

通过分子质量大小可区分多肽和蛋白质。Kyte（2006）认为，分子质量大于或等于8000 Da的多肽（即≥72个氨基酸）被称为蛋白质。例如，泛素（含72个氨基酸的单链）和酪蛋白α-S1（含200个氨基酸）称为蛋白质，而胰高血糖素（含有29个氨基酸）和催产素（9个氨基酸）称为肽。然而通过分子质量大小区分多肽和蛋白质的方法并不是绝对的。例如，胰岛素[51个氨基酸（A链含20个氨基酸和B链含31个氨基酸）]具有典型的蛋白质3级结构，因此被公认为一种蛋白质。而从猪小肠黏膜中分离得到的PEC-60（含60个氨基酸的单链）（Agerberth等，1989）和 dopuin（含 62 个氨基酸的单链）（Chen等，1997）被称为多肽。三氯乙酸（TCA，终浓度5%）或高氯酸（PCA，终浓度0.2M）可完全沉淀动物组织、细胞、血浆和其他体液（例如，瘤胃、尿囊、羊膜、肠腔液和食糜）（Rajalingam等，2009）中的蛋白质。同样，乙醇（终浓度为80%）也可以有效地沉淀水溶液中的蛋白质和核酸（Wilcockson1975）。这种方法可以有效去除蛋白质水解物中的水溶性无机化合物（如铝盐化合物）。

2　蛋白质水解物

蛋白质在酶、微生物、酸、碱作用下可产生蛋白质水解产物。工业上生成蛋白质水解物常用的蛋白源包括动物性蛋白质（如酪蛋白、乳清蛋白、肉类）和植物性蛋白（如小麦、水稻、大豆、豌豆和棉籽等）（Dieterich 等，2014；Pasupuleki等，2010；Pasupuleki等，2010）。蛋白质水解的方法不同，水解时间也从1～100 h不等。酶或微生物水解过程中添加抑菌或杀菌防腐剂（如苯甲酸）可延长其水解时间，通过加热可使酶失活从而终止水解反应。水解结束后，可通过离心、过滤或微过滤系统分离蛋白质水解物中的不溶性物质。多次过滤后可获得预期的透明清晰的水解溶液。必要时可通过炭粉进行脱色并除去溶液中的混浊物质。若需要除去水解产物中的盐，可将滤液进一步通过交换色谱，除去水解物中多余的盐。蛋白质水解产物中的微生物可以通过热处理（巴氏杀菌）的方法消除。最后，将蛋白质水解物进行干燥、包装，形成产品。

蛋白质水解产物包括游离氨基酸、小肽和大肽，且其比例随着蛋白质来源，水解过程中的水份含量、蛋白酶类型和微生物种类的不同而不同。水解度，即蛋白质被水解的程度，可通过裂解的肽键数目除以蛋白质中的总肽键数目，并乘以100计算的得到。肽键裂解数等于游离氨基酸的摩尔数加上PCA或TCA可溶性多肽的摩尔数。蛋白质水解产生的肽缺乏统一的标准样，因此定量动物、植物、微生物来源的多肽具有很大的技术挑战性。游离或肽键结合形式氨基酸的百分比含量计算方法如下：

游离氨基酸百分比/%＝游离氨基酸含量／蛋白总氨基酸含量×100；

多肽氨基酸百分比/%＝多肽氨基酸含量／蛋白总氨基酸含量×100；

由于氨基酸的分解程度有限（如酶解），因此多肽的百分比含量/%＝（蛋白质总氨基酸含量-自由氨基酸含量）/蛋白质总氨基酸含量×100。高效液相色谱法被广泛应用于测定游离氨基酸含量。高效液相色谱法和其他分析技术（如核磁共振、质谱、飞行时间质谱、肽图谱和离子交换色谱法）常被用来测定蛋白质水解物中多肽的含量（Sapan等，2015；McGrath 等，1972）。

2.1蛋白质的酸水解1920年法国化学家Braconnot首先报道了在高温下进行蛋白质（明胶）酸水解的方法。在110℃条件下，6mol/L HCl作用24 h可将蛋白质完全水解（Dai等，2014）。相同温度条件下用盐酸作用2～6 h可将蛋白质水解成多肽。酸水解后将产物蒸发、巴氏杀菌并喷雾干燥。大部分蛋白质酸水解产物用作增味剂（例如，水解植物蛋白调味剂），且蛋白质的酸水解成本低。然而，蛋白质在酸水解过程中色氨酸结构被完全破坏，部分蛋氨酸受到损失，同时将谷氨酰胺和天冬酰胺分别转化为谷氨酸和天冬氨酸（Pasupuleki等，2010）。

2.2蛋白质的碱水解强碱，如4M氢氧化钙、氢氧化钠或氢氧化钾等碱水解剂在高温下（如105℃）反应20 h可将蛋白质完全水解 （Dai等，2014；McGrath，1972）。食品工业生产中常用低温（例如，27～55℃）和短时间（如4～8 h）水解蛋白质产生多肽。碱水解产物经蒸发、巴氏杀菌并喷雾干燥，最后形成产品。与酸水解一样，蛋白质碱水解的成本也很低，并且不破坏色氨酸。然而，碱水解可破坏大多数氨基酸的结构。因此，碱性水解法通常用于生产发泡剂（如鸡蛋蛋白质的替代物）和泡沫灭火器，而很少应用于食品工业中。

2.3蛋白酶水解许多不同种类的蛋白酶均可将肽键裂解，根据反应类型的不同可将蛋白酶分为外肽酶（在蛋白质末端水解肽键）和内肽酶（在蛋白质内部水解肽键）。一些蛋白酶（二肽酶）可水解二肽，而其他的蛋白酶则将蛋白质末端（取代、环化或异肽键相连的）氨基酸残基移除（即肽键以外的αα-氨基-羧基；如ω-肽酶）。当蛋白酶对特定氨基酸肽键有明显的偏好性时，可以以其偏好的氨基酸对酶进行命名（如亮氨酸氨基肽酶、脯氨酸外肽酶）。相反，一些酶具有非常广泛的特异性，可用字母数字命名（例如，肽基二肽酶A，肽基二肽酶B，二肽酶I和二肽酶II）。一部分蛋白酶同时含有外肽酶和内肽酶的性质（例如，组织蛋白酶B和H）。酶法水解蛋白质需要的条件相对温和（例如，pH 6～ 8，30～ 60℃），可最大限度地减少水解过程中对蛋白质、氨基酸的破坏等副作用。

大部分用于生产水解蛋白质产物的酶来源于动物、植物和微生物（表1）。动物源酶（特别是猪源酶）包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、羧基肽酶和氨肽酶；植物源酶包括木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶；不同细菌和真菌来源的酶其反应温度、pH和离子浓度条件差异大，具有较广泛的选择范围（Kunst，2003；Dixon，1979）。商业化的酶可以是粗产品，或是经过半纯化、纯化的酶。单一酶（例如，胰蛋白酶）或多种酶混合（例如，链霉蛋白酶、胃蛋白酶和脯氨酸肽酶的混合物）均可水解蛋白质。酶的选择取决于蛋白质的种类和需要的水解程度。例如，水解含有较多疏水性氨基酸的蛋白质，需优先选择可裂解氨基酸肽键的酶。通常将蛋白质水解产物中特定的肽分离出来或除去意外的肽。某些蛋白质的水解 （如木瓜蛋白酶水解大豆蛋白与酪蛋白18 h）可以生成疏水性肽和苦味氨基酸（Kim等，2003）。蛋白水解过程中添加匀浆的猪肾皮质或活性炭可以减少苦味肽产生。与酸或碱水解蛋白过程相比，酶水解的主要优点是：（1）水解条件（如温度和pH值）温和，不会造成任何氨基酸的损失；（2）蛋白酶能特定并精确控制肽键水解的程度；（3）水解后可加热使酶失活（例如，85 ℃，3min），便于蛋白质水解产物的分离。

2.4微生物发酵微生物产生的蛋白酶可将细胞外蛋白质水解为大肽、小肽和游离氨基酸。小肽可进一步被微生物摄取并在细胞内水解，产生游离的氨基酸。微生物也可产生能同时分解碳水化合物和脂类的酶（Smid等，2013）。蛋白质发酵可分为液态发酵和固态发酵。液态发酵在高水分条件下进行，而固体发酵在低水分条件下进行，并可减少蛋白质水解物的干燥时间。

酱油是最早的微生物发酵产品。用于生产酱油的原料为煮熟的黄豆、烘烤过的谷物、盐和米曲霉或曲霉（一种真菌属）。在Koji发酵法，等量的大豆和小麦与曲霉、酱油曲霉、酿酒酵母和细菌（芽孢杆菌和乳酸杆菌）共培养用于发酵生产酱油。在过去的二十年中，许多微生物已被用于水解植物源蛋白质，如乳杆菌BGT10和乳酸杆菌LMG17315用于水解豌豆蛋白质；纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以及真菌、米曲霉或曲霉用于水解 大 豆 蛋 白 质 （Bah 等 ，2016；Li-Chan，2015；López-Barrios等，2014）。乳酸菌（如乳杆菌和乳球菌）通常用于发酵乳制品。发酵的主要优点在于微生物不仅可以将蛋白质分解为多肽和游离氨基酸，还能去除超过敏或抗营养因子（如胰蛋白酶抑制剂、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、植酸、寡糖棉子糖和水苏糖、皂甙大豆）。

表1　常用蛋白水解酶

3　蛋白质水解产生的生物活性肽

生物活性肽是蛋白质中除具有一定营养价值外还具有生物学功能的氨基酸片段 （López-Barrios等，2014）。其有抗菌、抗氧化、抗高血压和免疫调节作用。这些生物活性肽通常为2～20个氨基酸，但有些可能含有20个以上的氨基酸。许多生物活性肽具有共同的结构特性，如氨基酸含量少，疏水性氨基酸含量多，含精氨酸、赖氨酸和脯氨酸残基。在动物中，内源性肽发挥重要的生理或调节功能。例如，PEC-60能激活小肠和其他组织中的Na/K ATP酶。此外，小肠中的潘氏细胞能够分泌多种具有抗菌作用活性肽（Bevins等，2011）。大脑释放大量的肽可用于调节动物内分泌、采食量和行为活动（Engel等，2014）。

Zhanghi等（2010）报道，肽转运蛋白 1（PepT1）可将二肽和三肽通过肠上皮细胞的顶膜运输进入细胞。然而，由于小肠内含有肽酶，因此不可能将肠腔中大量的营养性功能肽输送入门静脉或淋巴循环系统。食物来源的肽可以在小肠中发挥生物活性（例如，生理调节）并将信号传输到大脑、内分泌系统和免疫系统，从而对全身产生有益的影响。

Mellander（1950）报道，酪蛋白是第一个被发现的可产生生物活性肽的蛋白质，该活性肽可通过维生素D依赖性信号促进佝偻病婴儿骨的钙化和生长。到目前为止，许多血管紧张素I转换酶抑制肽是从牛奶或肉类中产生的（表2）。血管紧张素I碳末端的组氨酸-亮氨酸二肽被血管紧张素I转换酶移除形成血管紧张素II（一种强有力的血管收缩肽），从而发挥抗高血压作用（Ryan等，2011）。常用的血管紧张素转换酶抑制肽药物有Ile Pro Pro（IPP）和 Val Pro Pro（VPP），两者都来源于乳蛋白（Power等，2013）。Martínez-Augustin 等（2014）研究表明，这两种肽可能不会被胃肠道完全水解，未被水解的肽可穿过肠上皮细胞被运送到血液中。同样，肉类（Ryder等，2016）和蛋黄中的蛋白质水解产物（Zambrowicz等，2015）也能产生有活性的血管紧张素转换酶抑制剂。

动物源（如鱼和肉）（表3）或植物源蛋白质饲料水解产物中的某些小肽通过清除自由基、抑制氧化物质的生成、或抑制炎性细胞因子的产生来发挥抗氧化功能 （Bah 等，2016；Power等，2013；Memarpoor-Yazdia等，2012；Shimizu 等，2007）。许多生物活性肽具有血管紧张素I转换酶抑制作用和抗氧化作用。另有报道指出，动物和植物蛋白质水解物中的某些肽（表4）与小肠内源性抗菌肽一样，有抗菌作用。这些抗菌肽可能通过破坏细菌的细胞膜，干扰细胞内蛋白质的功能，引起胞浆蛋白质聚集从而发挥抗菌作用 （Osman等，2016；Lima等，2015； Wald 等，2015），但潜在的作用机制还不清楚。此外，某些蛋白质，例如酪蛋白、面筋（存在与小麦、黑麦和大麦中）和大豆蛋白质在胃肠道内经水解可产生寡肽 （通常为4～8个氨基酸）（Froetschel，1996），其能与大脑中的阿片样受体结合从而影响动物肠道功能、采食量和行为（表5）。

3.1动植物蛋白水解物在动物营养中的应用Wu等（2014）报道，畜牧业的一个主要目标是提高牛奶、肉和蛋生产过程中的饲料利用效率，这就需要为小肠消化和吸收营养物质提供最佳的条件。到目前为止，植物和动物蛋白质水解产生的肽被广泛用于生产猪、家禽、鱼和宠物饲料，它们的应用能经济有效地提高动物生长和生产性能及肠道健康（McCalla等，2010）。其发挥作用的可能机制是：（1）小肠对小肽的吸收效率高于等量的游离氨基酸；（2）小肠中细菌对小肽的分解代谢率要低于等量的游离氨基酸；（3）相对于单个的氨基酸，小肽能通过肠道运输多种氨基酸进入静脉，使血液中氨基酸更平衡；（4）与等量的游离氨基酸相比，特定的肽能够改善胃肠道的形态和功能，比如分泌、蠕动以及抗炎反应。在猪营养研究中，多肽功能相关的研究主要集中于断奶仔猪阶段，多肽能够提高仔猪的适口性，促进生长，提高饲料转化效率和健康状况 （Kim 等，2010；Stein，2002；Kim等，2000；Lindemann 等，2000；Zimmerman，1996）。这主要由于幼龄动物的消化和免疫系统不成熟，断奶后经常出现采食量降低，肠黏膜萎缩、腹泻和生长发育受阻等。此外，已经有商业化多肽产品应用到犊牛 （Lalles等，1995），家禽 （Opheim等，2016；Frikha 等，2014），鱼类（ Khosravi等，2015；Refstie 等，2005）和宠物（Nagodawithana 等，2010）饲料中，其能改善动物的营养状况，肠道功能以及抗病能力。

表2　动物产品水解产生的降压肽

表3　动物蛋白质水解产生的抗氧化肽

表4　动物蛋白质水解及肠黏膜细胞产生的抗菌肽

表5　动植物蛋白质在胃肠道经酶水解后产生的阿片样肽

3.2植物多肽植物性蛋白质往往含有致敏蛋白和抗营养因子，幼龄动物和宠物饲料中含有这些物质往往会降低植物蛋白的营养价值。例如，大豆可以加工制成大豆粉和大豆蛋白浓缩物，以消除一部分抗营养物质。然而豆制品中仍然含有大量蛋白质类型的过敏原（如大豆球蛋白和β-大豆蛋白）和胰蛋白酶抑制剂、外源凝集素（血凝素）、植酸、大豆低聚糖（棉子糖和水苏糖）和甾体苷（大豆皂苷）。已有报道指出，利用微生物（如霉菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌）发酵大豆可提高断奶仔猪生长性能和饲料利用率。3～7周龄仔猪日粮中添加3%～6%大豆粉（玉米和大豆为基础日粮），其生长率与添加相同比例脱脂奶粉仔猪的生长率不相上下。同样的，以玉米和大豆为基础饲料的3～7周龄猪日粮中添加4.9%发酵的大豆粉可以代替3.7%喷雾干燥的血浆蛋白，并且不降低猪生长性能或者饲料转化率。大西洋鲑鱼饲喂含40%发酵大豆白片，也得到了相似的结果。而在红鲷幼鱼的日粮中，50%鱼料可以被替换成相同比例的大豆蛋白质水解物。考虑到鱼粉在世界各地变得越来越稀缺，饲料中添加植物蛋白水解物对于水产养殖的发展十分重要。此外，大豆分离蛋白（占日粮19.7%）水解物可作为昂贵的脱脂奶粉的替代品被用于维持幼牛的高生长性能。酸性植物蛋白质水解物（如麦麸含有大量的谷氨酰胺和谷氨酸）通常称为水解植物蛋白，因其中含有丰富的谷氨酰胺，因此在宠物饲料中添加1%～2%可提高饲料适口性。

3.3动物多肽断奶仔猪日粮中添加6%喷雾干燥的小肠水解产物（SDPI；肝素生产的副产品），饲喂两周后发现，仔猪的生产性能要优于饲喂添加血浆蛋白粉基础日粮组、及添加乳清粉基础日粮仔猪。哺乳仔猪补饲小肠水解产物SDPI，可使仔猪在断奶后3～5周表现出更好的生长性能 ，这可能是由于仔猪肠绒毛面积增加了，营养物质被更好的消化和吸收 。与此相类似，Stein（2002）报道指出，给断奶仔猪（20日龄断奶）饲料中添加1.5%、3%或4.5%SDPI比添加相同含量鱼粉的仔猪，有更好的生长性能和饲料转化效率。并且SDPI的作用呈剂量依赖性。此外，给断奶仔猪饲喂含6%酶蛋白水解产物 （来自猪血液和选定家禽组织混合物），其生长性能和饲料转化效率与饲喂含有相同比例喷雾干燥血细胞日粮的仔猪相近。同样地，在玉米和大豆粉为基础的日粮中，添加2.5%、5%或者7.5%的水解猪黏膜蛋白，能够增加生长雏鸡的日增重以及提高其营养水平。另外，采食含5%的大西洋鲑鱼蛋白质水解物 （来自内脏）的鸡其生长性能优于采食含或不含4%的鱼食日粮的鸡。日粮中鱼副产品蛋白水解物的添加（10%）能够促进欧洲幼鲈鱼的生长和肠道发育、免疫性能，并提高其在鳗弧菌 （一种革兰氏阴性菌）感染下的存活率（Kotzamanis等，2007）。因此，SDPI和其他动物蛋白质水解物在动物生产中具有良好的应用前景。

4　小结

植物和动物蛋白质水解物能够产生易消化的多肽、生物活性肽以及特定的氨基酸（如谷氨酸），其能为动物提供了一定的营养、生理或者调节作用。这些蛋白质水解物的工业生产方法包括：（1）强酸或强碱法；（2）温和的酶促反应；（3）微生物发酵。水解度通过蛋白质中肽键断裂的数目除以蛋白质总的肽键数目来计算。化学水解通常用来产生香味，而微生物发酵不仅能产生肽也能去除蛋白质成分中的抗营养因子。除了提供氨基酸的营养价值以外，生物活性肽还具有抗菌、抗氧化、抗高血压和免疫调节作用。这些肽能有效改善动物肠道形态、功能并提高动物（包括猪、仔牛、鸡、宠物和鱼）对多种感染性疾病的抵抗能力，进一步提高生长性能和饲料转化率，改善动物健康状况。将动物副产品或植物性饲料转化为优质蛋白质水解物后用于饲喂家畜、家禽和鱼类是一种非常经济有效的方式。

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