玉米蛋白水解物对奶牛瘤胃体外发酵及纤维素酶活的影响

姜　鑫，　刘　帅，　徐宏建，　张永根

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030）

玉米蛋白粉是工业上利用玉米生产淀粉后产生的主要副产物之一，其蛋白质含量较高，约占干物质的60%～75%，还含有脂肪和纤维素等成分。玉米蛋白粉的代谢能高于玉米，氨基酸总量高于豆粕和鱼粉，目前作为蛋白补充，被广泛应用于饲料生产中。然而由于玉米蛋白粉中主要含有醇溶蛋白和谷蛋白，醇溶蛋白分子中存在大区域的α-螺旋结构，具有很强的疏水性，谷蛋白只溶于碱水溶液，二者的水溶性差，且氨基酸不平衡，导致玉米蛋白粉在反刍动物体内不易被消化吸收，对瘤胃微生物发酵和群体结构的影响明显低于鱼粉和豆粕（王梦芝，2009）。利用微生物发酵玉米蛋白粉，可以将其中的玉米蛋白水解为小的短肽分子，这类短肽分子具有多种功能，如抗氧化 （Luo等，2014）、免疫等功能。研究表明，玉米蛋白水解物（CPH）可以促进瘤胃微生物生长，改善瘤胃坏境（程茂基等，2004）。据报道，CPH可以提高豁眼鹅的生长性能（童辉等，2009），减弱生鸡肉靡脂质氧化（许瑞雪等，2016）。国外也有报道，CPH对大鼠肝组织损伤具有一定的治疗作用 （Luo等，2014），并且还可以提高蛋鸡的生产性能（Gunawardana等，2009）。目前关于CPH在奶牛生产中应用的研究鲜有报道，因此，本试验研究了在全混合日粮（TMR）中添加CPH对奶牛瘤胃体外发酵及纤维素酶活的影响，以期为CPH能够应用于奶牛生产中提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1CPH制备利用微生物发酵法制备CPH。具体方法如下：玉米蛋白粉与麸皮以8∶2的比例混合作为培养基，料水比（m/V）＝1∶2，以纳豆芽孢杆菌：脉孢霉为7∶3的比例接种，接种量为0.31%（m/m），接种顺序为先接种脉孢霉，12 h后再接种纳豆芽孢杆菌，32℃培养40 h后取5 g发酵后的玉米蛋白粉于50 mL离心管中，添加一定比例的去离子水（1∶9，m/V），漩涡振荡器振荡 2min，40 ℃条件下恒温振荡1 h，20000 g离心，离心后用0.22μm滤膜过滤，真空冷冻干燥滤液得CPH，-20℃保存备用。

1.1.2TMR体外发酵底物为TMR，基础日粮组成及营养水平见表1（干物质基础）。

1.2供体动物及瘤胃液的采集3头安装永久性瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛，体重（600±25）kg，每日饲喂两次（07:00和18:00），自由饮水。奶牛饲喂日粮营养水平与发酵底物相同（表1）。晨饲前1 h分别采集3头奶牛的瘤胃液，均匀混合，瘤胃液通过四层纱布进行过滤。

表1　基础日粮组成及营养水平

1.3试验设计本试验采用单因素完全随机试验设计，设Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个处理组，分别添加0、0.06、0.12 g/L 和 0.24 g/L CPH， 每个处理设 3个重复，进行奶牛瘤胃体外发酵试验。

1.4体外发酵分别称取 13.2 g CaCl2·2H2O、10.0 g MnCl2·4H2O、1.0 g CoCl2·6H2O、8.0 g FeCl3·6H2O、4.0 gNH4HCO3、35.0 gNaHCO3、5.7 gNa2HPO4、6.2 g K2HPO4、0.6 g MgSO4·H2O、0.1%刃天青及 4mg NaOH，加入蒸馏水定容至l000 mL，制成缓冲液（pH 6.9），通入CO2至过饱和。并按瘤胃液∶缓冲液以1∶2的比例混匀，配置人工瘤胃液。准确称取0.2 g底物加入到纤维袋内，并置入100mL注射器内，加入30 mL体外发酵液，置于恒温水浴摇床中，39℃下恒温培养。

1.5样品采集和指标测定采集体外发酵24 h内发酵液，经四层纱布过滤，用于测定pH、菌体蛋白和纤维素酶浓度，部分按与发酵液相应比例添加25%的偏磷酸，用于测定瘤胃液VFA和NH3-N的浓度。所有样品放于-20℃冰箱保存。

1.5.1发酵液pH、NH3-N和VFA浓度测定采用 pH（Startorius，PB-10）测定体外发酵 24 h 内发酵液pH；采用冯宗慈比色法测定瘤胃液NH3-N浓度；采用气相色谱仪（岛津GC-2010，日本）测定瘤胃液中VFA浓度。

1.5.2发酵液菌体蛋白浓度测定采用嘌呤法（刘晶等，2014）测定发酵液中菌体蛋白浓度。

1.5.3发酵液纤维素酶活性和干物质消失率测定纤维素酶活性的测定参照 《反刍动物营养学研究方法》中的方法 （王加启，2011）。酶活单位（IU）指每分钟每毫升酶液作用于底物生成的还原糖量（μmol）。

采集体外发酵24 h内发酵液后，取出纤维袋，蒸馏水冲洗3次后，在105℃下烘干4 h，干燥器中冷却后称重，计算体外干物质消失率。

1.6数据统计分析

产气量计算公式为：GP＝a＋b（1-exp-c×t）；

式中：a为可溶性快速产气量，mL/0.1 g底物；b为不可溶性慢速产气量，mL/0.1 g底物；c为产气速率GP/h。

利用SAS 9.2的非线性（NLIN）方程对气体产率进行分析。有效产气速率（EGp）计算公式为：

式中：c为产气速率常数；k为一段速率常数，假定为 0.05/h（Wang 等，2012）。

其他数据采用SAS 9.2软件包中的mixed模型，根据正交多项式系数表选择3阶系数对数据进行趋势性分析，P＜0.05表示差异显著，结果用“平均值±标准误”的形式表示。

2　结果

2.1CPH对体外发酵24 h产气量的影响CPH对体外发酵24 h产气量的影响见表2和图1。随发酵时间延长，各组发酵液产气量呈上升趋势。24 h试验组产气量、慢速产气部分、潜在产气部分和有效产气速率均显著高于对照组（P＜0.05），其中试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ产气量分别较对照组升高5.32%、7.45%和10.64%。且随添加量的增加，各组产气量呈线性增加。

表2　CPH对体外发酵24 h产气量的影响

图1　添加不同水平CPH体外发酵24 h内产气量的动态变化

2.2CPH对体外发酵24 h pH、NH3-N和VFA浓度的影响CPH对瘤胃pH、NH3-N和VFA浓度的影响见表3和图2～7。随发酵时间延长，各组发酵液pH呈下降趋势。24 h试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ发酵液pH分别较对照组降低0.60%、0.75%和1.35%（P＜0.05），且随添加量的增加，各组发酵液pH呈线性下降。

随发酵时间延长，各组发酵液NH3-N浓度呈现上升趋势。24 h试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ发酵液NH3-N浓度分别较对照组升高3.05%、4.67%和11.42%（P＜0.01），且随添加量增加，各组NH3-N浓度呈线性增加。

表3　CPH对体外发酵24 h pH、NH3-N和VFA浓度的影响

图2　添加不同水平CPH体外发酵24 h内pH的动态变化

图3　添加不同水平CPH体外发酵24 h内NH3-N浓度的动态变化

图4　添加不同水平CPH体外发酵24 h内乙酸浓度的动态变化

图5　添加不同水平CPH体外发酵24 h内丙酸浓度的动态变化

图6　添加不同水平CPH体外发酵24 h内丁酸浓度的动态变化

图7　添加不同水平CPH体外发酵24 h内总挥发酸浓度的动态变化

随着发酵时间延长，各组发酵液总挥发酸、乙酸、丙酸和丁酸浓度呈现上升趋势。24 h试验组发酵液总挥发酸、乙酸、丙酸和丁酸浓度均极显著高于对照组（P＜0.01），其中试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别较对照组升高16.81%、19.97%和23.57%，并随添加量的增加呈线性升高，且具有一定的二次和三次效应，试验组Ⅲ和Ⅳ乙比丙值较对照组分别降低10.00%和7.92%（P＜0.01）。

2.3CPH对体外发酵24 h纤维素酶活、菌体蛋白和体外干物质消失率的影响CPH对体外发酵24 h纤维素酶活性、菌体蛋白浓度和体外干物质消失率的影响见表4。24 h试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ发酵液内水杨甘酶含量分别较对照组升高1.24%、6.19%和8.05%（P＜0.01），且各组发酵液内水杨甘酶含量随CPH添加量增加呈线性升高。

表4　CPH对体外发酵24 h纤维素酶活、菌体蛋白和体外干物质消失率的影响

24 h试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ发酵液内菌体蛋白浓度分别较对照组升高12.48%、30.37%和24.95%（P＜0.01），并随添加量增加呈线性升高。

24 h试验组Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ体外干物质消失率分别较对照组升高 1.42%、8.74%和 12.31%（P＜0.05），并随添加量增加呈线性升高。

3　讨论

3.1CPH对奶牛瘤胃体外发酵的影响产气量的变化与挥发性脂肪酸产量和微生物蛋白合成的变化呈正相关（Krishnamoorthy 等，1991），产气量和干物质消失率越高，饲料利用率越高。本试验中，添加CPH处理产气量和干物质消失率都显著高于对照组，可能与菌体蛋白浓度和挥发性脂肪酸产量增加有关。可见添加CPH有利于饲料在瘤胃内的降解，提高饲料利用率。

pH、VFA和NH3-N浓度是评价瘤胃发酵的重要参数（Wanapat等，1999）。当pH长时间低于6.2时，瘤胃内纤维素降解菌降解纤维素的能力会下降，严重时会导致奶牛瘤胃酸中毒（Erdman等，1982）。本试验中，随着CPH添加量的增大，pH呈现下降趋势，但一直维持在6.58～6.67，有利于瘤胃发酵。pH降低的主要原因可能是TMR中加入CPH后促进了瘤胃微生物活动，增加了发酵液中VFA的含量。VFA的主要作用是为反刍动物提供能量，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。瘤胃内部分细菌、真菌和原虫的主要发酵产物为乙酸、丙酸和丁酸，且瘤胃内纤维素酶降解纤维的主要产物为乙酸。本试验中，添加CPH提高了总挥发酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量，可能是由于瘤胃内微生物相对菌群数量和纤维素酶含量的增加所致。王文娟等（2011）研究发现，在肉牛日粮中添加大豆肽显著提高了瘤胃内VFA含量，与本试验结果趋势相近，随着CPH添加量的增加VFA含量呈递增趋势。研究表明，牛奶中乳糖含量与瘤胃内丙酸含量呈正相关（Miller-Webster等，2002），且乙酸和丁酸为合成牛奶中脂肪的前体物质。因此，我们推测CPH对奶牛产奶性能有一定的潜力。NH3-N是瘤胃内氮代谢的主要产物，原虫和部分蛋白降解菌通过降解日粮中的蛋白质产生NH3-N，并为瘤胃微生物合成菌体蛋白提供原料。NH3-N在瘤胃内含量一般处于动态平衡，研究发现，瘤胃内NH3-N含量适宜范围为15～30 mg/100 mL（Wanapat等，1999）。本试验中，添加不同水平的CPH可以提高菌体蛋白含量并在合理范围内提高NH3-N含量，这可能与原虫和某些蛋白降解菌相对菌群数量增加有关。有研究指出，瘤胃内原虫和蛋白降解菌相对菌群数量的增加会引起NH3-N含量增加（Sun等，2013），为微生物提供氮源，从而使菌体蛋白含量增加。王文娟等（2011）对瘤胃灌注小肽对肉牛瘤胃发酵与营养物质消化代谢的影响发现，大豆小肽可以提高瘤胃内菌体蛋白和NH3-N浓度。说明添加CPH可以提高瘤胃NH3-N的含量，提供氮源，进而促进瘤胃微生物合成菌体蛋白。

3.2CPH对纤维素酶活的影响羧甲基纤维素酶又称内切葡聚糖酶，这类酶可作用于纤维素内部非结晶区，从高分子内部任意切开β-1，4糖苷键，产生带有非还原性末端的小分子纤维素；水杨苷酶又称外切葡聚糖苷酶或纤维二糖酶，这类酶可以将短链的非还原性末端纤维二糖残基逐个切下降解晶体纤维素。这两类纤维素酶活性的强弱，可间接说明瘤胃内纤维降解程度。瘤胃内纤维降解菌可以产生纤维素酶，主要用于分解纤维素。本试验中，添加不同水平的CPH羧甲基纤维素酶活性无明显变化，但水杨苷酶活性显著高于对照组，主要原因可能是CPH使瘤胃内某些纤维降解菌相对菌群数量增加所致，其具体机理仍需进一步研究。刘春龙等（2006）研究表明，从丝兰属植物中提取出的一种具有生物活性的物质丝兰皂苷可以提高瘤胃内纤维素酶活，并随添加水平的升高而增强，与本试验结果相似。说明添加CPH可以提高瘤胃内纤维类物质的降解率，从而提高纤维在消化道内的消化率。

4　结论

本试验结果表明，TMR中添加CPH可以改善瘤胃发酵，提高瘤胃内纤维素酶活性，从而提高饲料利用率，其中以添加0.24 g/L为宜。

[1]程茂基，卢德勋，王洪荣，等.不同来源肽对培养液中瘤胃细菌蛋白产量的影响[J].畜牧兽医学报，2004，35（1）：1 ～ 5.

[2]刘春龙，李忠秋，孙海霞.丝兰皂甙对绵羊瘤胃酶活及日粮养分48 h降解率的影响[J].西北农林科技大学学报:自然科学版，2006，34（4）：28 ～ 31.

[3]刘晶，刘建新.饲料果胶对瘤胃微生物菌群和发酵特性及蛋白质合成的影响[J].中国畜牧杂志，2014，50（23）：93 ～ 98.

[4]童辉，栾新红，宁志利，等.玉米蛋白多肽对昌图豁眼鹅屠宰性能及脏器系数的影响[J].中国家禽，2009，31（10）：8 ～ 10.

[5]王梦芝.不同蛋白质饲料对瘤胃微生物体外发酵和群体结构的影响[J].动物营养学报，2009，21（5）：673 ～ 679.

[6]王文娟，万发春，杨维仁，等.瘤胃灌注大豆小肽对肉牛瘤胃发酵的影响[J].动物营养学报，2011，23（8）：1324 ～ 1331.

[7]王加启.反刍动物营养学研究方法 [M].现代教育出版社，2011.145～147.

[8]王文娟.瘤胃灌注小肽对肉牛瘤胃发酵与营养物质消化代谢的影响：[硕士学位论文][D].山东泰安：山东农业大学，2011.

[9]许瑞雪，刘晓兰.玉米蛋白水解物对生鸡肉糜脂质氧化的影响[J].中国调味品，2016，41（8）：5 ～ 10.

[10]Erdman R A，Hemken R W，Bull L S.Dietary sodium bicarbonate and magnesium oxide for early postpartum lactating dairy cows：effects on production，acid-base metabolism，and digestion[J].J Dairy Sci，1982，65（5）：712 ～ 731.

[11]Gunawardana P，W u G，Yuan K，et al.Effect of dietary protein and peptide in corn-soy diets on hen performance，egg solids，egg composition and egg quality of hy-line w-36 hens during second cycle phase three[J].Inte JPoulSci，2009，8（4）：317 ～ 322.

[12]Krishnamoorthy U，Steingass H，Menke K H.Prelim inary observations on the relationship between gas production and microbial protein synthesis in vitro[J].Arch AnimNutr，1991，41 （5）：521 ～526.

[13]Luo J，Zhang W，Yan L I，et al l.Treatment of corn peptide on antioxidant system damage of hepatic tissue in m icrowave radiated rats[J].Chin JVetMed，2014，9：26 ～ 27.

[14]M iller-WebsterT，Hoover W H，Holt M，et al.Influence of yeast culture on rum inalm icrobialmetabolism in continuous culture[J].JDairy Sci，2002，85（8）：2009 ～ 2014.

[15]Sun P，W ang JQ，Deng L F.Effectsof Bacillus SubtilisNatto on m ilk production，rumenfermentation and ruminalm icrobiome of dairy cows[J].Animal，2013，7（2）：216 ～ 222.

[16]W ang M，Meng XY，Yang RL，et al.Cordycepsm ilitaris polysaccharides can enhance the immunity andantioxidation activity in immunosuppressed mice[J].CarbohydrPolym，2012，89（2）：461 ～466.

[17]W anapatM，Pimpa O.Effect of rum inal NH3-N levelson rum inal fermentation，purine derivatives，digestibility and rice straw intake in swamp buffaloes[J].Asian Austral JAnimSci，1999，12 （6）：904 ～907.