少腹逐瘀汤对子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜HIF-1α表达的影响※

曹　颖　白素芬　杜晨光　谢　伟　刘慧娟

子宫内膜异位症（endometriosis，EMT） 是一种子宫内膜腺体和间质种植于子宫腔以外的雌激素依赖性疾病。在育龄期女性中的发病率为10%，在不孕女性中的发病率高达30%～45%[1]。主要表现为痛经、盆腔痛及不孕，严重困扰着处于黄金时期的部分女性。根据被绝大多数学者所接受的异位种植学说，EMT源于脱落的内膜随经血逆流进入腹腔，经“黏附-侵袭-血管形成”三步曲种植于腹腔或其他脏器表面[2]。经期螺旋小动脉收缩，子宫内膜处于缺氧状态[3]，内膜碎片进入腹腔后，在血管生成前，内膜缺氧将持续存在。而适度的缺氧恰恰能够减少内膜细胞凋亡，从而有利于内膜异位种植[4]。缺氧和缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α） 已成为内异症的研究热点。在内异症病理标本中，HIF-1α表达明显增加[5-6]。研究表明，在缺氧环境中HIF-1α的稳定表达，提高了异位内膜间质细胞的侵袭能力[7]，促进了细胞中血管生成相关基因的转录[8]。而侵袭及血管生成是异位内膜种植生长的必要条件，由此说明HIF-1α在EMT的发生发展中起着重要作用。

目前，中医药疗法被广泛应用于内异症的治疗。中医学认为，内异症属中医“血瘀证”范畴，寒凝血瘀是内异症最常见的证型之一[9]。以活血化瘀、温经止痛立法的经典名方少腹逐瘀汤是治疗寒凝血瘀型内异症的常用方剂。为进一步明确少腹逐瘀汤对子宫内膜异位症的治疗作用及其疗效机制是否与改善了异位病灶的缺氧状态有关，本研究通过建立自体移植子宫内膜异位症大鼠模型，观察少腹逐瘀汤治疗对异位病灶体积及HIF-α表达的影响，为其临床应用提供更多的实验室研究证据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠50只，雌性，体质量（200±20） g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK-（军） 2014-0001。

1.1.2实验药物及试剂 少腹逐瘀汤：根据王清任《医林改错》原方所载的药味及配方比例，处方：当归9 g，生蒲黄9 g，五灵脂6 g，赤芍6 g，小茴香3 g，醋延胡索3 g，没药3 g，川芎3 g，肉桂3 g，炮姜0.6 g。以上中药购于北京同仁堂唐山连锁药店有限公司。采用传统煎煮方法，除肉桂外其他药物加水300 mL浸泡1 h，煮沸后，文火煎煮60 min；肉桂后下，煎煮20 min；滤出药液，浓缩至1 g/mL。兔单克隆HIF-1α抗体 （ab463，美国abcam公司），小鼠单抗GAPDH抗体（sc32233，美国Santa cruz）。1.2动物造模及分组 50只大鼠适应性喂养10 d，每日阴道涂片检查动情周期。选择连续有2个正常动情周期的大鼠，共计48只，于动情期造模[10]。造模前24 h予戊酸雌二醇0.2 mg/只灌胃。2%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。在无菌条件下，以尿道口上端约1 cm处为切入点，沿腹中线切开1.5～2 cm的纵形切口，进入腹腔。结扎右侧子宫，取子宫中间段约1.5 cm，纵形剪开宫腔，剪取5 mm×5 mm大小的子宫组织，生理盐水反复冲洗。将子宫内膜面贴向左侧腹膜血管丰富处，用5-0非吸收性缝合线缝合组织四角，逐层关腹。术后连续3 d腹腔注射青霉素钠15万U/只。术后第10天起灌胃戊酸雌二醇0.02 mg/只，连续5 d。造模后第28天，陆续选取动情期大鼠剖腹检查确定造模是否成功。若移植的子宫内膜体积增大，呈透明的结节状或囊状，内有液体积聚，表面有结缔组织覆盖及血管形成，则认为造模成功。造模成功的大鼠共计38只，用随机数字表法分为模型组及治疗组，每组19只。治疗组给予少腹逐瘀汤灌胃，按人体正常给药量46.6 g/d，根据大鼠体表面积换算为大鼠给药量，模型组灌胃等体积生理盐水。每周根据大鼠体重变化调整灌胃量，连续灌胃4周。药物干预期间，模型组有1只大鼠死于灌胃意外，治疗组有1只大鼠因咬伤死亡。

1.3指标检测

1.3.1异位病灶体积 于造模后第4周、给药后第4周行剖腹探查，用电子游标卡尺测量并记录异位病灶的长、宽、高，计算病灶体积V=0.52×长×宽×高[11]。

1.3.2大鼠异位内膜组织形态学观察 将异位内膜组织用10%甲醛溶液固定48 h，经梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，常规HE染色，光学显微镜下观察异位内膜组织形态学变化。

1.3.3Western blot法检测HIF-1α表达 异位病灶取材后提取蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，每泳道上样蛋白50μg，电泳并转膜。将膜置于1∶200 HIF-1α一抗中，4℃孵育过夜。二抗羊抗兔IgG 37℃孵育2 h，显色1 min，Image J软件测定条带光密度值。

1.4统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计学分析。实验数据以均值±标准差进行描述；符合正态分布的两组数据比较，采用独立样本t检验或配对样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1少腹逐瘀汤对异位病灶体积及形态学的影响 治疗前，模型组与治疗组异位病灶体积差异无统计学意义（P＞0.05）。经4周药物干预后，模型组异位病灶体积较治疗前增大，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组异位病灶体积较治疗前缩小，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗组异位病灶体积小于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。与模型组相比，治疗组异位内膜中腺体数量减少，腺上皮细胞数量减少，间质细胞排列疏松，见图1。

表1　少腹逐瘀汤治疗前后异位病灶体积变化　(x±s，mm3)

图1　模型组与治疗组的异位内膜组织HE染色（×100）

2.2少腹逐瘀汤对异位子宫内膜组织中HIF-1α蛋白表达的影响 Western blot结果显示，治疗组HIF-1α表达下调，是模型组的58.8%，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2　模型组与治疗组异位子宫内膜组织中HIF-1α蛋白表达

3　讨论

经典的内异症病因学说认为经血逆流是内异症的起因。子宫内膜碎片随经血进入腹腔时，必然要经历缺血、缺氧的改变。为了适应低氧环境，细胞通过上调或下调几百种蛋白编码基因的表达创造出了精妙而复杂的适应机制[12]，如改变糖代谢，细胞凋亡、增殖、侵袭，血管生成等。缺氧诱导因子（HIFs）是细胞应对缺氧环境最关键的调节因子，HIF-1是HIFs中最具代表性的因子，几乎在各种细胞均有表达。由α、β两个亚基形成异二聚体结构，可以激活近百种靶基因转录，调控细胞在缺氧应激下的生物学行为。其中β亚基不受氧环境影响而稳定表达；α亚基在常氧环境中被泛素蛋白酶体迅速降解，在低氧环境中才能稳定表达。因此HIF-1的活性主要依赖于α亚基。低氧条件下，稳定表达的HIF-1α发生核转位进入细胞核内，与HIF-1β形成二聚体，结合于靶基因启动子区的缺氧反应元件（Hypoxia response element，HRE），形成转录起始复合物，启动靶基因转录[13-14]。有研究发现，异位病灶间质细胞中HIF-1α表达明显高于正常子宫内膜间质细胞[15]。而异位子宫内膜细胞中HIF-1α的稳定表达，能够上调一系列促进血管生成的基因如血管生成因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）、瘦素，同时后者又能够促进间质细胞增殖[15]。此外HIF-1α还能够上调环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2， COX-2） 的表达，COX-2是催化花生四希酸转化为前列腺素的关键酶[16]。因此，HIF-1α表达上调与内异症病灶的持续炎症状态密切相关。异位病灶局部微环境中前列腺素E2的增多，又可以改变多种类固醇合成基因的表达，从而更有效地促进细胞中的胆固醇转化为雌二醇[17]。由此可知，HIF-1α又可能参与了异位病灶局部雌激素的合成。综上所述，HIF-1α可能通过调控血管生成、雌激素代谢、炎症因子表达等多种途径参与了内异症发生发展的过程，是治疗内异症的潜在靶标。

我们的研究表明，少腹逐瘀汤能够减少异位病灶局部HIF-1α的蛋白表达，这可能是其治疗内异症的作用机制之一。然而少腹逐瘀汤下调HIF-1α表达的具体机制尚不清楚，可能与活血化瘀药物改善了病灶局部微循环状态有关。从形态上看，异位病灶血管呈现密集的网状分支特征，与肿瘤血管的分布特征类似，这样的血管分布不利于血流灌注。在病灶发展过程中，缺氧状态无法彻底改善。病灶局部VEGF、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 的高表达同时也提示局部微血管的渗透性增加[18]，从血管渗出的炎细胞局部浸润，将进一步促进细胞增殖加重氧耗。如此看来血管生成似乎并不能够完全解决组织缺氧的问题，反而形成了“血管生成-炎细胞浸润-细胞增殖-耗氧量增加”的恶性循环。这与中医理论对于EMT属“血瘀证”的病机认识不谋而合。少腹逐瘀汤是否通过改善病灶局部微循环，改变了病灶的缺氧环境，从而减少了HIF-1α的表达，将是我们进一步研究的重要方向。

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