肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用分析

吴萍萍，沈亭海，凌学士

（1.池州职业技术学院,安徽池州 247000；2.巢湖市畜牧兽医局,安徽巢湖 238000；3.合肥市动物疫病控制中心,安徽合肥 230000）

当前，随着生活方式的转变，人们开始不断追求更高的生活质量，对牛奶和奶制品方面的需求呈上升趋势，奶牛养殖业的发展逐渐向规模化、集约化及现代化转型。然而，饲养工业的发展问题、疾病防治手段及饲养管理水平方面的不良因素，空气、水源等污染造成饲养环境中病原微生物的增多、奶牛发病率升高现象，同时症状较为复杂，甚至出现复合感染，致病因素由多种致病菌的共同作用取代了之前的单种因素。其中最为常见的疾病则是奶牛乳房炎，其发病机制是多种致病微生物共同作用，产生局部炎性病变。相关数据统计显示，全世界患有乳房炎的奶牛在6000万头以上，由此每年会造成2000亿元左右的损失，奶牛由此被淘汰的数量占据3%左右，而在我国，奶牛乳房炎的发病率在46.5%～85.6%，也就是说每一头牛都会损失1200～3600元，产生的经济损失是巨大的。在奶牛养殖业中，奶牛乳房炎对产奶量有不良影响，同时也会在一定程度上降低奶牛泌乳功能，造成淘汰结果，特别是隐性乳房炎，其特点为发病率高、隐蔽性强，不出现明显的体征。另一方面，具有疾病的奶牛，其产出的奶质量也会大幅度下降，对人们的生活健康形成威胁。

1　奶牛乳房炎病菌和症状分析

1.1奶牛乳房炎病菌 奶牛乳房炎作为当前对世界奶牛养殖业产生重大影响的严重疾病之一，主要病因是葡萄球菌、链球菌和肠道杆菌感染。当前对奶牛乳房炎最为有效的治疗方法是采用抗生素治疗，然而，长期以来抗生素的滥用使奶牛乳房炎病菌逐渐出现了耐药性，且发病率不断增加，目前甚至发现超级耐药菌株，增加奶牛乳房炎的临床治疗难度。

1.2奶牛乳房炎症状和诊断 奶牛乳房炎分为两种，即临床型乳房炎和隐性乳房炎。其中临床型乳房炎症状非常明显，肉眼能看出炎性变化、乳房肿胀及泌乳量降低，从而进行诊断。被细菌感染的奶牛，其临床症状体现为乳房局部存在炎性反应、泌乳量呈现降低趋势、食欲减退及精神抑郁；若为病毒感染，则表现为丘疹、水泡等，继而造成细菌感染，出现乳房炎；若为真菌感染，其症状则为奶牛发热、产奶量降低、乳腺出现肉芽肿样组织变化。

隐性奶牛的诊断相对来说较为复杂，其中最为准确的方式是对乳汁中的微生物进行微生物学检验，之后进行病原微生物分离。一般来说，其步骤主要是病原微生物的分离和培养，鉴定其特性、形态和生理，之后采取针对性治疗。用于检测奶牛乳房炎最常用的方式为乳汁体细胞计数，同时也是奶牛健康评价指标。

2　肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用

而肉桂醛作为肉桂科植物提取物的主要生物有效物质，是一种单一的有机化合物。肉桂醛液体特征为无色或者淡黄色，具有很强的香气，难溶于水，可与醇、醚相融，具有易氧化、挥发性质，但对酸、碱不稳定。肉桂醛在医药方面应用较为广泛，主要功能有杀菌消毒防腐；抗溃疡、加强胃肠道运动；促进脂肪分解（涂小丽等，2015）；有效抗病毒、抗癌；有利于扩张血管，并具有降压作用等。一般在外用药和合成药中也较为常见。

2.1肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌作用的研究进展 相关研究报道指出，造成奶牛乳房炎的致病微生物种类超过100种，有接触类传染病原菌、环境病原菌、细菌、病毒及真菌。其中接触类传染病原菌有沙门氏菌、停乳链球菌、无乳链球菌、金黄的葡萄球菌等；环境病原菌中有酵母菌、大肠杆菌、疱疹病毒等；细菌有表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等，另外还有些产气杆菌属、克雷伯氏菌属等；病毒有牛痘病毒牛乳头炎、口蹄疫病毒等；真菌则有隐球菌属、毛孢子菌属等。除此之外还有一些支原体。

一些研究证实，肉桂醛可特异性对细菌细胞壁葡聚糖和几丁质的合成产生破坏作用，在损伤细胞壁后，对细胞内的微结构产生损伤作用，以达到消灭细菌的目的（陈玲玲等，2015）。肉桂醛可对大肠杆菌产生胁迫作用，使大肠杆菌细胞中存在过量的活性氧，升高超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力，对细胞膜脂质造成深度氧化损害，进一步破坏细胞结构，消灭大肠杆菌。同时，肉桂醛在饲料行业中主要用于饲料添加剂使用，对畜禽生长发育起到促进作用，并提升饲料转化率；具有防治动物感染性疾病作用，同时对饲料中的霉菌有抑制作用。在牛饲料中添加肉桂醛能充分发挥瘤胃改良剂的作用，提升养牛效益。程浩等（2017）充分利用肉桂醛的特点，即抑菌、低毒及可作为牛饲料添加剂，研究了对奶牛乳房炎主要病原菌的抑菌作用。

2.2肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌抑制作用的实验分析

2.2.1实验材料选择 实验材料为金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）、无乳链球菌（S.agalactiae），自鲜乳样中分离、纯化、鉴定后获取；选取标准菌种金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）和大肠杆菌（ATCC 43890）作为对照使用；营养琼脂和营养肉汤培养基；分析纯选用无水乙醇；98%的肉桂醛溶液。

2.2.2配制菌液和药液 取液氮中40%甘油保护的各个菌株储备菌液100 μl，在相对应的培养基中混匀；在对应液体、固体培养基中连续划线接种、扩繁两次，使菌株生命力保持旺盛。在无菌、37 ℃，200 r/min条件下，各菌株的单菌落在相对应的液体培养基中迅速生长，显微镜下用倍比稀释法进行计数，将菌液稀释为1×108CFU/mL并冷藏；98%的肉桂醛稀释时使用75%酒精1：9的比例进行，将其浓度稀释为741.5 mmol/L，并在-20 ℃的温度下保存。

3　实验结果

3.1对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用

3.1.1对奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）MIC的测定是利用各个菌株对应的液体培养基稀释法进行，将菌株所对应的液体培养基、肉桂醛、稀释菌液分别加入灭菌试管中如表1，直至细菌为5×105CFU/mL，在温度为37℃的环境下培养0.5～1 d；对试管中的液体进行肉眼观察，其透明、不分层及培养前的最小肉桂醛浓度作为MIC，同时需要保持在重复3次后MIC没有产生变化。

3.1.2 对奶牛乳房炎主要致病菌生长的影响 采用生长曲线进行观察：在无菌条件下，分别选取相对应的菌株固体培养基，将菌落放置在3 mL对应的液体培养基试管中，之后放置在生化培养箱中进行培养，保证无菌条件；再将培养后的3 mL培养基转接到97 mL的液体培养基中，并使其在37 ℃、200 r/min条件下快速生长。然后将菌液分别放置在6个50 mL的三角锥形瓶中，每个锥形瓶中放置15 mL，且5个锥形瓶中肉桂醛的浓度分别为 1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、一个乙醇浓度为0.05%。将其在37 ℃、200 r/min 的条件下进行培养，并在 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h对OD值进行测量，得到相应曲线。

3.2对奶牛乳房炎主要致病菌的杀灭作用

3.2.1对奶牛乳房炎主要致病菌的最小杀灭浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC） 程浩等（2017）的研究表明，肉桂醛可有效杀灭奶牛乳房炎主要致病菌，不同的致病菌所使用的浓度具有一定差异。本次实验进行最小杀灭浓度的研究，得出以下结果。

3.2.2对奶牛乳房炎主要致病菌杀菌的影响

同样采用曲线进行观察，与以上处理相同，且5个锥形瓶中肉桂醛的浓度分别为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MBC、2 MBC、一个乙醇浓度为 0.05%。取样和稀释的时间分别为 0、1、3、5、7、9、12、18 h，同样采用平板法对活菌数进行计数，之后得出曲线。

3.3结果

3.3.1肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用 肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌都能产生抑制，其中标准金黄色葡萄球菌的MIC为1.6 mmol/L，金黄的葡萄球菌的MIC为3.2 mmol/L；标准大肠杆菌的MIC为3.2 mmol/L，大肠杆菌MIC为6.4 mmol/L；链球菌MIC为1.6 mmol/L。其中，在对照组中加入最大剂量的稀释剂后，并不会对奶牛乳房炎主要致病菌的生长产生影响（见图 1～ 3）。

图1　肉桂醛浓度对大肠杆菌生长曲线的影响

图2　肉桂醛对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

图3　肉桂醛对大肠杆菌的杀菌曲线

肉桂醛的浓度为1/16 MIC、1/8 MIC时，对奶牛乳房炎主要致病菌无明显影响；浓度为1/4 MIC、1/2 MIC时，主要致病菌生长滞后，证实在此浓度下可有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌。

3.3.2肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌的杀灭作用 肉桂醛对奶牛乳房炎主要致病菌都可起到杀灭作用，其中标准金黄色葡萄球菌的MBC为12.8 mmol/L，金黄色葡萄球菌的MBC为25.6 mmol/L；标准大肠杆菌的MBC为12.8 mmol/L，大肠杆菌的MBC为25.6 mmol/L；链球菌MBC为12.8 mmol/L（见图4～ 6）。

图4　肉桂醛对大肠杆菌的杀菌曲线

图5　肉桂醛对金黄色葡萄球菌的杀菌曲线

图6　肉桂醛对无乳链球菌的杀菌曲线

添加0.05%乙醇、培养时间为7h时的测量结果显示，各细菌数仅有所增长，且增长数量约为10倍左右。而添加肉桂醛且浓度为1/8 MBC时可产生较高的杀灭效果；浓度为1/4时无明显杀灭作用；浓度为1/2 MBC时，18 h内均无法完全杀灭细菌；浓度为1 MBC、2 MBC时，7 h内能杀灭致病菌，且相比之下，2 MBC时杀菌效果较高。

肉桂醛的性质主要有易氧化和挥发性，在与其他的物质结合后，便于保存同时增强抑菌效果。本次实验分析结果充分表明，肉桂醛的使用能有效抑制奶牛乳房炎主要致病菌，从抑制效果上看，明显高于乙醇产生的效果；依照细菌耐药性的标准（MBC≥32 MIC）能够看出，奶牛乳房炎主要致病菌并没有对肉桂醛产生耐药性，充分说明肉桂醛是一种潜在的奶牛乳房炎临床治疗药物，当前研究已经证实肉桂醛的使用可产生有效的抑菌效果，但仍需进行深入研究。另外，也有些研究证实（胡飞等，2017），肉桂醛在植物提取肉桂油、柠檬醛、牛至油中使用能产生最佳的抑制效果，且相较于大肠杆菌的抑制效果，金黄色葡萄球菌的抑制效果较高。本次实验的结果显然与相关研究结果一致，且肉桂醛对链球菌产生的抑菌效果更大。

对于肉桂醛抑菌的作用机制，有些研究提出肉桂醛主要是对真菌和细菌结构及功能产生破坏，导致细菌死亡；也有些说法认为肉桂醛进入细胞内部（卢杨柳，2016），并对基因的正常表达产生影响，同时还干扰细胞代谢，产生抑菌效果。

4　结语

养殖业发展最重要是质量和产量，面对当前养殖业发展问题，应积极寻找有效的改善方式。针对饲料中的安全和质量问题，更应与饲料行业合作，共同进行研究，合理解决。在本文分析过程中明确指出，奶牛乳房炎主要致病菌可采用肉桂醛进行抑制和杀灭，从而保障奶牛产量和质量，效果之佳证实了在实际发展中的使用价值。综上所述，应合理使用肉桂醛，且添加在饲料中有利于奶牛产量和质量提升，同时促进养殖业的发展。

[1]陈玲玲，玉柱，毛培胜，等.中国饲草产业发展概况及饲草料质量安全现状[J].饲料工业，2015，36（5）：56～60.

[2]程浩，周梦洁，胡飞，等.肉桂醛体外抑制奶牛乳房炎主要致病菌的研究[J].中国兽药杂志，2017，51（3）：39～43.

[3]胡飞，程浩，叶葱葱，等.肉桂醛防治奶牛乳房炎的安全性评价[J].黑龙江畜牧兽医，2017，（12）：153 ～ 155.

[4]卢杨柳.肉桂醛对食源性致病菌的抑制动力学模型及其作用机制[D].河南农业大学，2016.

[5]涂小丽，钟芳，邓伏清，等.微生物发酵饲料对生长猪生产性能和营养物质利用率的影响[J].饲料工业，2015，36（4）：36～38.

[6]许女，史改玲，程宏乾，等.牛源乳酸菌的粘附特性及对奶牛乳房炎大肠杆菌的粘附抑制研究[J].中国食品学报，2017，17（1）：20～30.