基于ITS系列分析鉴定野生灵芝属菌种*

袁 滨，严俊杰，柯丽娜，张志鸿，赖碧梅

（1.漳州市农业科学研究所，福建 漳州 363005；2.福建农林大学生命科学学院，菌物研究中心，福建 福州 350002）

漳州位于福建省东南部，地处东经117～118、北纬23.8～25之间，辖区地势由北西向东南倾斜，西北多山，东南濒海，气候温和，属亚热带季风性湿润气候，自然条件独特，环境条件复杂多样，食用、药用菌资源丰富[1]。笔者从南靖等地采集、分离到多个野生大型真菌菌种，同时成功驯化栽培部分菌株，如编号为西灵5的灵芝属（Ganoderma）菌株，其子实体朵形漂亮，出芝整齐，产量较高，极具开发利用价值。该试验以分离菌种为材料，通过ITS序列克隆与分析，对其进行分子鉴定和栽培出菇试验，旨在鉴定其遗传进化关系，进而为开发利用当地野生食用、药用菌的菌种资源提供研究基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1供试菌种

试验菌种如表1所示。

1.1.2培养基

表1　供试菌种Tab.1　Introduction of tested strains

液体培养基：去皮土豆200 g，切块后加水煮烂（约25 min），再用纱布过滤去掉土豆渣，定容至1 L，然后加入葡萄糖 5 g·L-1、蔗糖 15 g·L-1、磷酸二氢钾2 g·L-1、硫酸镁1 g·L-1，熔化后再定容至1 L即可。固体培养基：液体培养基中加入琼脂粉18 g·L-1。pH 自然，121℃灭菌 20min。

1.1.3试剂

DNA提取试剂：CTAB抽提液：2%CTAB，EDTA （pH8.0） 20 mmol·L-1， Tris-HCl（pH8.0） 100 mmol·L-1， NaCl 1.4 mol·L-1； CTAB 沉 淀 液 ： 1%CTAB， EDTA （pH8.0）10 mmol·L-1， Tris-HCl（pH8.0） 50 mmol·L-1；CTAB/NaCl（200 mL）：去离子水 150 mL，NaCl 8.2 g，CTAB 20 g，65℃加热搅拌，定容至200mL；TE缓冲液：EDTA 1mmol·L-1，Tris-HCl 10 mmol·L-1。其他：DNA Marker、10×buffer、rTaq酶、dNTPs等均购自宝生物工程（大连）有限公司，其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。ITS引物和内切酶，购自上海生工生物工程技术服务有限公司，稀释后浓度为10mol·L-1。

1.2　方法

1.2.1菌丝体分离纯化

将采集回来的子实体进行组织分离，挑尖端菌丝2次，获得纯培养物，保藏于冰箱，工作温度4℃。

1.2.2菌株的分子鉴定

（1） 基因组DNA的提取

将7个菌株接种于液体培养基，26℃培养12 d后，收集菌丝1.5 g。各菌株基因组DNA的提取参考CTAB法[2-3]，改进后提取各供试菌株的DNA。

（2） ITS系列PCR扩增

采用真菌通用引物ITS1、ITS4对样品进行PCR扩增，PCR体系如表2所示。

ITS-PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

表2　PCR扩增体系Tab.2　Reaction systems of PCR

ITS-PCR产物的检测：取ITS-PCR产物6μL加入1μL 6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀，1.0%琼脂糖凝胶（含0.5μg·mL-1GoldviewTMDNA染料） 进行电泳，电压为4 V·cm-1，电泳1 h后通过凝胶成像系统观察并拍照。

（3）ITS片段的克隆与测序

按照pMD18-TVector的说明书进行操作。阳性克隆经PCR验证后，委托上海生工进行测序。在GenBank上对所得序列进行BLAST比对分析[4-6]，采用MEGA5.10软件，Clustalw进行多序列比对，NJ法构建系统进化树，自检值（Bootstrap） 设置为1000，确定供试菌株的分类地位。

（4） 栽培出芝试验

为初步探索野生菌株代料栽培的可能性与开发利用潜力，于2016年8月进行大棚栽培试验。栽培料配方：阔叶树杂木屑85%、麸皮10%、豆粕2%、轻质碳酸钙3%，各物料混合均匀后堆积发酵30 d，期间翻堆4次，处理方法同参考文献[7]。装袋后常压灭菌12 h，（25±1）℃室内养菌，28 d左右菌丝满袋，统一后熟7 d，之后在大棚内开袋进行出芝管理[8-10]。

2　结果与分析

2.1　野生菌种基因组DNA的提取和PCR扩增结果

采用CTAB改良法提取各菌株的基因组DNA，用分光光度计检测OD260/OD280的比值在1.8～2.0，琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA纯度较高，结构完整，无明显降解。各野生菌种DNA的电泳图见图1，从左至右依次为：MK、白灵芝、白芝2号、西灵1、西灵5、长泰灵芝、松杉灵芝、农大灵芝。

从图1可以看出，供试菌株西灵5、农大灵芝的PCR产物片段大小为700 bp～750 bp，与预期结果较为一致，表明该方法提取获得的DNA质量较好，可以用于后续分子鉴定。

图1　野生菌种DNA电泳图Fig.1　DNA electrophoretogram ofwild strains

2.2　构建系统发育树

将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将各菌株测序后的结果在Gen Bank上进行比对，同时采用MEGA5.10软件，Clustalw进行多序列比对，NJ法构建系统进化树，自检值（Bootstrap） 设置为1000，上述7种真菌的BLAST比对结果见表3和图2。

表3　7种真菌的BLAST比对结果Tab.3　BLAST comparison of 7 fungi

测序结果显示白灵芝、白芝2号、西灵1、西灵5、长泰灵芝、松杉灵芝、农大灵芝的ITS序列分别为 655 bp、696 bp、638 bp、734 bp、669 bp、684 bp、705 bp。基本可以明确白芝2号为雅致栓孔菌（Trametes elegans），西灵 1为假芝 （Amauroderma rugosum），西灵5和长泰灵芝为韦伯灵芝（Ganoderma weberianum），松杉灵芝为赤芝（Ganoderma lucidum），农大灵芝与四川灵芝（Ganoderma sichuanense）接近，白灵芝与Nemania bipapillata较接近。

2.3　栽培试验结果及子实体形态特征

初步对7个供试菌株进行栽培出芝试验，具体见图3。

图3　野生灵芝子实体Fig.3　Wild Ganoderma lucidum fruiting body

从图3可以看出，白芝2号、西灵5、农大灵芝、西灵1等4个菌株成功培育出子实体。西灵5子实体单生，菌盖半圆形，菌盖表面新鲜时紫褐色，有漆样光泽；菌盖上表面生长初期和边缘为白色，触摸后变为褐色；菌柄偏短，侧生，与菌盖同色；朵形漂亮，出芝整齐，产量较高。白芝2号子实体无明显菌柄，新鲜时革质，干后硬革质，与培养基连接紧密；菌盖半圆形、扇形；菌盖表面白色、乳白色或浅灰白色，近基部有瘤状突起。西灵1子实体单生，有菌柄，干后木栓质；菌盖近圆形，表面灰褐色至褐色，无光泽，具明显同心环纹，无绒毛，中心部分凹陷；孔口表面新鲜时灰白色，手触后变血红色、黑色；菌肉褐色至深褐色。农大灵芝分化不好。尽管还有3个菌株没能培育出子实体，但4个出菇菌株的形态特征从侧面佐证了分子生物学鉴定结果是可信的。

3　结论与讨论

本研究通过ITS序列测序与分析，对采集到的6个野生真菌菌种进行分子鉴定，结合传统形态学研究，初步确定西灵5等菌株的分类地位，并进行了栽培出菇试验，为西灵5、白芝2号、西灵1等菌株的开发利用提供了重要依据。

图2　基于ITS构建的NJ进化树Fig.2　NJevolutionary tree based on ITS

野生生物资源为生物资源的有效利用和开发奠定基础，对野生大型真菌种质资源的收集、驯化，已成为当前科研工作的一个重点[11]。但单纯依据形态学对野生大型真菌进行分离鉴定存在诸多缺陷，尤其是一些形态特征相似的种，区分起来难度很大，这就需要结合分子生物学手段来进行鉴定。在野生大型真菌的分类鉴定中，一般认为菌株的ITS序列相似性达到或超过99%，可以认为他们是同一个种。本研究结合形态学特征和ITS序列测序，可以确定西灵5等菌株的具体种属，但并不能肯定白灵芝等的种属，需要进一步研究。

参考文献：

[1]漳州市政府网.漳州概况[EB/OL].(2017-10-26)[2017-11-23].http://www.zhangzhou.gov.cn/cms/html/zzsrmzf/zzgk/index.html.

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[11]肖自添，刘明，何焕清.一株野生乌芝的鉴定及其生物学特性研究[J].广东农业科学，2016（3）：72-77.