高温胁迫处理香菇杂交子育种初探

常 堃，蔡 婧，李世华，李 军，刘 杰，张九玲，李为民，肖 艳，田继成

（十堰市农业科学院，湖北 十堰 442000）

双单杂交技术是由“布勒现象”[1]衍生而来，是1种目的性较强的常规育种手段，香菇的有性生殖方式为异宗结合。利用双单杂交技术，将具有优良特性的香菇双核菌丝，对需要改良菌株的单核菌丝进行双单配对，形成双核菌丝，从而选育出新的杂交菌株。

高温胁迫导致包括香菇在内的各种生物体产生一系列生理紊乱，是生理学研究的重要领域之一[2-3]。本研究使用双单杂交技术，先对亲本菌株进行杂交，再对所得杂交子菌丝进行高温逆境胁迫处理，获得一些菌丝可以正常生长的杂交子，随之进行出菇对比试验，初步筛选出了具有利用价值的杂交子。

1　材料与方法

1.1　供试菌株

香菇L808、L9319引自浙江省丽水市大山菇业研究开发有限公司，香菇9608引自河南西峡县真菌研究所。

1.2　培养基

单孢子分离培养基：PDA培养基。双单杂交培养基：PDA培养基。逆境胁迫培养基：木屑80%、麸皮19%、石膏1%，含水量50%～55%，试管尺寸18mm×180mm。

1.3　菌种配方

木屑60%、细木屑20%、麸皮18%、石膏1%、石灰1%，含水量50%～55%。

1.4　栽培料配方

木屑80%、麸皮19%、石膏1%，含水量50%～55%。

1.5　双单杂交

收集L808的单核菌丝，与供体L9319和9608的双核菌丝分别对峙培养于同一PDA试管中，双核菌丝位于试管底部，单核菌丝位于试管中部，菌丝块之间相差4 cm～5 cm，25℃培养10 d～15 d后，挑取单核菌丝靠近试管前端的边缘菌块镜检，具有锁状联合者视为杂交成功，并于试管中进行扩大培养。

1.6　逆境胁迫处理

将扩大培养的杂交子菌丝接入试管木屑培养基中，棉花塞封口，25℃暗培养10 d，待菌丝萌发延伸，将菌丝至于35℃培养箱中进行培养直到菌丝长满试管，培养箱为电热恒温培养箱（无水盘加湿）。

椎体转移性肿瘤常见于恶性肿瘤晚期，会严重影响患者的生活质量和生存期限。目前对于脊柱转移性肿瘤的治疗存在不少争议，缺乏客观量化的标准来指导治疗方案［1-3］。脊柱肿瘤评分系统中，Tomita评分与脊柱转移瘤的预后密切相关，可作为外科干预决策的重要参考标准［4］。根据Tomita评分，4～7分者预期寿命较长，一般情况尚可的患者，可通过局限性手术来稳定脊柱，减轻疼痛，改善生活质量。

1.7　杂交新菌株的筛选

将菌丝可以长满试管的杂交子直接制种，28℃暗培养30 d～40 d，然后淘汰菌丝生长过慢和无法萌发延伸的杂交子。

1.8　栽培试验和子实体形态、形状的观察

按上述培养料配方，采用地面斜靠栽培模式进行对比试验，每个品种设3次重复，代料干重1.2 kg·袋-1。记录各杂交子的污染率和子实体产量，计算其生物学效率，对每个杂交子子实体随机取样，测定各杂交子菌盖厚度、菌盖直径和菌柄直径。

2　结果与分析

2.1　双单杂交

将L9319和9608分别与收集的80份L808单核菌丝进行双单杂交，获得L9X8（L9319与L808双单杂交） 杂交子63株，获得9X8（9608与L808双单杂交） 杂交子56株。

2.2　逆境胁迫处理结果

逆境胁迫处理后共获得31株杂交子，其中L9X8有22株，9X8有9株。制种后获得15株杂交子菌种，其中L9X8有12株，9X8有3株。

2.3　栽培试验结果

2.3.1杂交子养菌结果的比较

表1列出了各杂交子在不同时期的污染情况。

由表1可知，大部分杂交子菌丝抗杂能力很差，污染集中表现在刺孔后，只有L9X8-3和L9X8-40的菌丝生长良好。

2.3.2进入出菇期杂交子特征

表1　杂交子污染情况Tab.1　Contamination of hybrids

表2列出了能够出菇的杂交子的出菇分布情况和产量。

表2　杂交子产量情况Tab.2　Yield of hybrids

由表2可见，大部分杂交子产量很低，且集中在前2潮出菇，杂交子L9X8-3呈爆发性出菇，且产量最高，均产达到988.9 g·棒-1，而杂交子L9X8-7在第3潮开始出菇。经过逆境处理能够正常生长的杂交子菌丝吃料情况无明显差异。产量方面除L9X8-3外，其余杂交子产量均低于对照。部分杂交子子实体特征见图1、图2和表3。

图1　L9X8-7子实体形态Fig.1　Morphology of L9X8-7 fruiting body

图29X8-40子实体形态Fig.2　Morphology of 9X8-40 fruiting body

表3　部分杂交子子实体特征Tab.3　Fruiting body characteristics of parthybrids

从表3、图1和图2可以看出，经过逆境处理后，部分杂交子子实体特征表现为L9X8-7子实体大量出现畸形，经测量菌柄平均直径达到24.73mm，菌盖不易开伞；9X8-40子实体菇形大，易开伞，容易形成片菇。

3　讨论

单单杂交、双单杂交、多孢自交已广泛使用在食用菌育种中，本研究经过逆境胁迫处理所获杂交子L9X8-3呈现出爆发性出菇、子实体丛生、菌盖面黑、产量高等特点，高产的特征值得将其作为育种材料进一步进行回交试验；9X8-40子实体特征为板菇（俗称的大片菇），虽然这一特点不管是在鲜销市场还是干货市场均不被看好，但其比较符合美国香菇工厂化品种的需求，拥有一定的潜在价值；杂交子L9X8-7在第3潮开始出菇（7月份），此高温出菇的特征值得将其作为育种材料进一步研究，而且其菇柄肥厚，很适合用于香菇加工，随着香菇产业的不断发展，该品种同样拥有一定的潜在价值。

本研究采用对杂交菌株进行高温逆境胁迫的处理方式。结果表明，所获部分杂交子在子实体形态方面有了明显改变，至于获得杂交菌株性状能否遗传，则有待于进一步研究。

参考文献：

[1]Bak WC,Lee TS,Lee WK,et al.Selective breeding and hybridization ofLentinus edodesstrains for bed-log cultivation[J].Journal of Korean Forestry Society,1996,85(2):309-315.

[2]Moller IM,Jenesen PE,Hansson A.Oxidativemodifications to cellular componcents in plants[J].Annu Rcv Plant Biol,2007,58(1):459-481.

[3]Ferreia AS,Totola MR,Borges AC.Physiological implications of trehalose in the ectomycorrhizal fungusPisolithussp,under thermal stress[J].J.Therm.Biol.,2007,32(1):34-41.