Notch1信号对银屑病患者外周血Th17细胞分化和功能的影响

马蕾　薛海波　高梅兰　舒春梅　于娟　张俊花

256603山东，滨州医学院附属医院皮肤科（马蕾、舒春梅、于娟、张俊花），内分泌与代谢病科（薛海波），检验科（高梅兰）

银屑病是免疫相关的慢性复发性炎症性皮肤病，其皮损组织中大量的T淋巴细胞及分泌的细胞因子形成异常的免疫微环境，导致表皮角质形成细胞异常分化［1⁃2］。Th17细胞是以分泌白介素17（IL⁃17）为特点的CD4+T淋巴细胞亚群，在以银屑病为代表的皮肤疾病中发挥重要作用［3⁃5］。Notch信号通路作为一种高度保守的信号转导通路，在细胞分化、发育过程中尤其是在T淋巴细胞分化中起关键作用［6］。有研究表明，在小鼠和人促Th17细胞分化的细胞因子环境中均有Notch1信号分子的活化［7⁃8］。本研究通过检测银屑病患者外周血单个核细胞（PBMC）Notch1信号通路的表达变化以及抑制Notch1信号对银屑病患者Th17细胞分化和功能的影响，探讨Notch1信号通路在银屑病中的作用及机制。

对象与方法

一、研究对象

2015年9月至2016年10月滨州医学院附属医院门诊就诊的35例寻常性银屑病患者，男19例，女16例，年龄18～42（28.7± 6.4）岁，皮损面积与疾病严重程度评分（PASI）为 12.6～27.8（20.42±3.83）。入选标准：初诊未治或近1个月内未采用系统药物、光疗、生物制剂及外用药物治疗者。健康对照组为32例健康体检者，男18例，女14例，年龄20～43（32.5±6.7）岁。两组间性别分布、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过滨州医学院附属医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

二、主要试剂及仪器

聚蔗糖、磷酸盐缓冲液（PBS）、佛波酯、钙离子载体、布雷菲德菌素A、二甲基亚砜（DMSO）、（2S）-N-N-（3，5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）（美国Sigma公司），胎牛血清、RPMI 1640培养液（美国Gibco公司），异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD4单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记的IL⁃17单克隆抗体、抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体、重组人白介素1β（IL⁃1β）、重组人肿瘤坏死因子β（TGF⁃β）、重组人IL⁃6、重组人IL⁃23、抗干扰素γ（IFN⁃γ）抗体、抗IL⁃4抗体（美国eBioscience公司），Trizol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司），Quantscript RT Kit反转录试剂盒、RealMaster Mix试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，IL⁃17酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R&D公司），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），Rotor⁃Gene 3000实时PCR仪（澳大利亚Corbett Research公司）。

三、方法

1.标本采集：采集受试对象空腹外周静脉血10 ml，3 ml用于分离血清，7 ml采用聚蔗糖密度梯度离心法分离获取PBMC。

2.流式细胞仪检测Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整PBMC至2×106/ml，分别加入50 μg/L佛波酯、1 mg/L钙离子载体和10 mg/L布雷菲德菌素A，37℃、5%CO2条件下共刺激培养5 h；细胞膜FITC⁃CD4单克隆抗体标记，透膜、固定后PE⁃（IL⁃17）单克隆抗体胞内染色；应用FACS Calibur流式细胞仪检测，每例重复3次，winMDI 2.9软件分析数据。

3.实时定量反转录PCR检测PBMC中维A酸相关孤儿核受体γt（RORγt）、IL⁃17、Notch1及发状分裂相关增强子 1（Hes⁃1）mRNA 表达水平：采用Trizol RNA提取试剂提取PBMC中总RNA，紫外分光光度仪测定纯度，吸光度比值（A260/A280）在1.8～2.0之间为合格标本。反转录合成cDNA第1链。RORγt、IL⁃17、Notch1、Hes⁃1及β肌动蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。实时PCR定量检测，每份标本设3个复孔。计算mRNA相对表达量（2⁃△△Ct），△△Ct=（Ct试验样本目的基因-Ct试验样本内参基因）-（Ct校准样本目的基因）-Ct校准样本内参基因）。

4.ELISA检测IL⁃17含量：将倍比稀释的标准品、血清或经上述刺激的PBMC培养上清液及样品稀释液分别加至标准品孔、样品孔及空白对照孔，每例设3个复孔，按照试剂盒说明书检测IL⁃17浓度。

5.γ分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch1信号：将10例银屑病患者PBMC分别接种于24孔板，每孔 0.5 ml，密度为1× 106/ml；每例患者PBMC随机分为5组，以DMSO溶解DAPT，RPMI 1640培养液调整DAPT终浓度分别为0（对照组）、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L，DMSO终浓度低于0.1%，对照组为含等量DMSO的RPMI 1640培养液；每组细胞设3个平行孔，37℃、5%CO2条件下培养72 h。

6.CD4+T淋巴细胞的活化与极化：将上述PBMC转移至被5 g/L抗CD3单克隆抗体及2 g/L可溶性抗CD28单克隆抗体包被的培养板中，加入10 μg/L重组人IL⁃1β、50 μg/L重组人IL⁃6、20 μg/L 重组人 IL⁃23、10 mg/L抗IFN⁃γ 抗体及10 mg/L抗IL⁃4抗体，37℃、5%CO2条件下培养72 h。

7.统计学方法：采用SPSS17.0软件包进行统计学处理，计量资料以x±s表示，外周血中各检测指标表达水平比较采用独立样本t检验，各指标之间的相关性检测采用Pearson相关分析；各浓度DAPT处理组检测指标表达水平比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　Notch1、发状分裂相关增强子1（Hes⁃1）、维A酸相关孤儿核受体γt（RORγt）、白介素17（IL⁃17）和β肌动蛋白引物序列

图1　流式细胞仪检测健康对照（1A）和银屑病患者（1B）外周血单个核细胞Th17细胞比例

结　果

一、银屑病患者PBMC中Th17细胞比例

银屑病患者PBMC中Th17细胞占CD4+T淋巴细胞比例为2.863%±0.969%，对照组为0.604%±0.124%，两组比较，t=13.677，P＜ 0.01。见图1。

二、银屑病患者外周血RORγt等mRNA表达水平及血清IL⁃17含量

银屑病患者 PBMC 中 RORγt、IL⁃17、Notch1、Hes⁃1 mRNA表达水平及血清中IL⁃17含量均高于对照组（P＜0.01）。见表2。

三、银屑病患者PBMC中Notch1 mRNA表达水平与PASI等指标的相关性

银屑病患者外周血Notch1 mRNA表达水平与PASI（r=0.584）、Th17细胞比例（r=0.544）、RORγt mRNA表达水平（r=0.518）、IL⁃17 mRNA表达水平（r=0.549）及血清IL⁃17含量（r=0.511）均呈正相关（P＜ 0.05）。

四、DAPT阻断Notch1信号对银屑病患者PBMC中Th17细胞比例等指标的影响

不同浓度DAPT组Th17细胞比例、RORγt mRNA表达水平、IL⁃17 mRNA表达水平及培养上清液IL⁃17含量差异均有统计学意义（P＜0.01），2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L DAPT组各检测指标均低于对照组（P＜0.05），且随DAPT浓度增加，Th17细胞比例、RORγt及IL⁃17表达水平呈降低趋势。见表3。

表2　银屑病患者外周血单个核细胞中维A酸相关孤儿核受体γt（RORγt）、白介素17（IL⁃17）、Notch1、发状分裂相关增强子l（Hes⁃1）mRNA表达水平（2⁃△△Ct）及血清中IL⁃17含量（x±s）

表3　不同浓度γ分泌酶抑制剂DAPT处理组银屑病患者外周血单一核细胞Th17细胞比例和维A酸相关孤儿核受体γt（RORγt）、白介素17（IL⁃17）mRNA表达水平（2⁃△△Ct）及培养上清液IL⁃17含量（x± s）

讨　论

本研究结果显示，Th17细胞及其特异性转录因子RORγt、效应性细胞因子IL⁃17在银屑病患者外周血中均呈高水平表达，说明Th17细胞在银屑病病程中发挥重要作用。

有研究表明，Notch1信号分子在银屑病皮损组织中高表达，并参与角质形成细胞的分化调控［2，9⁃12］。本研究结果显示，Notch1信号分子及其靶基因Hes⁃1在银屑病患者外周血中明显高表达，且与Th17细胞比例、RORγt及IL⁃17表达水平呈正相关，表明Notch1信号分子参与银屑病发生发展过程。阻断Notch1信号通路可明显下调Th17细胞相关细胞因子产生，减轻Th17细胞及其效应细胞因子IL⁃17介导的实验性自身免疫脑脊髓膜炎的疾病进程，利用siRNA特异性阻断Notch1信号分子表达同样能够抑制IL⁃17在极化的人Th17细胞中的表达和分泌［7⁃8］。Notch1信号通路亦能调控Th17细胞特异性转录因子RORγt［13］，特异性阻断Notch1信号分子能导致RORγt的表达水平降低［7］。本研究结果显示，Notch1信号阻断剂DAPT能降低银屑病患者PBMC中Th17细胞比例及其特异性RORγt、IL⁃17的表达与分泌，且随DAPT浓度增加上述指标呈降低趋势。我们前期研究发现，DAPT能够剂量依赖性降低银屑病小鼠模型脾脏Th17细胞比例及RORγt、IL⁃17的表达［14］。以上研究结果表明，在银屑病疾病过程中，Notch1信号分子发挥对Th17细胞分化和功能的调控作用。进一步开展Notch1信号干扰或过表达对银屑病Th17细胞分化和功能影响的研究，将更加明确该信号通路对银屑病Th17细胞的调控机制。

综上，银屑病患者高表达的Notch1信号分子可能通过促进Th17细胞分化及IL⁃17表达与分泌，增加Th17细胞的致炎作用，促发和加重银屑病皮损的炎症反应，Notch1信号分子可能成为银屑病治疗的一个新靶点。

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