先天性手足分裂畸形的分子遗传学及基因诊断研究进展

陈政升　陈瓅　石文暘　许彦　王斌　韩刚

手足分裂畸形（Split-hand/foot m alformation，SHFM）是一种主要影响手/足中心线发育的先天性畸形。其发病率约为1/18 000，占所有四肢畸形的8%～17%。手足分裂畸形临床表现多样，包括中央列单指发育不全（图1），中央列多个手指的分化发育异常或缺失（图2），最严重的是先天性单指，其典型特征是肢端中央列和桡侧列均发育不全（图3）。

四肢由胚胎肢芽发育而来。肢芽包括两层细胞：外胚层细胞及其包裹的快速增殖的间充质细胞。三个特定区域细胞产生信号分子调节肢芽形成，分别是顶端外胚层嵴（Apical ectodermal ridge，AER），增生区（Progress zone，PZ）和极性活化区（Zone of polarizing activity，ZPA），相互作用并从三个空间维度（远近轴、前后轴、腹背轴）决定了肢体的形态。成纤维细胞生长因子（FGFs）、骨形成蛋白（BMPs）及 AER产生的WNT和MSX等信号分子和转录因子，将相邻的间充质细胞维持在持续增殖和未分化的状态，从而形成了PZ[1]。PZ的持续增殖细胞决定了肢芽的远近轴极性。如果AER和PZ无法维持，则会影响到远端的形成，引起手足分裂畸形。

手足分裂畸形多为散发。家族性手足分裂畸形大部分按照常染色体显性的模式遗传，也发现过其他遗传形式。手足分裂畸形可作为一个独立的病症出现，也可与其他的先天畸形合并发生，如唇腭裂、外胚层发育不良/迟缓及精神迟滞等。最常见的手足分裂畸形相关综合征有EEC综合征、LMS综合征、EEM综合征、ADULT综合征和DLDMS综合征等。除遗传因素外，环境因素（如AER中发生的细胞凋亡等）也可引起手足分裂畸形的发生。

本文将详述非综合征型手足分裂畸形的基因位点及突变形式，探讨引起疾病发生的分子通路和机制，为基因诊断和遗传咨询提供依据。

图1　中央列缺失和发育不全Fig.1　Defect and dysplasia of central rays

图2　中央列多个指列缺失和分化发育异常Fig.2　Multiple defect of central rays and abnormality of differentiation

图3　中央列和桡侧列同时发育不全Fig.3　Dysplasia of both central and radial rays

1　SHFM1（7q21）（OMIM 183600）

SHFM1由7q21.3-q22.1区域染色体重排引起，大多是新发生的突变，也可由常染色体显性方式遗传，常伴有较低的外显率和多样的表现型。35%的SHFM1患者合并有神经性耳聋[2]。该区域包括一些肢体发育的相关基因，如DSS1、DLX5和DLX6等[3-4]。小鼠DSS1同源基因主要在胚胎肢芽间充质细胞表达。因此，胚胎发育早期DSS1表达减少可能与手足分裂畸形的发生有关[3]。DLX5和DLX6引起手足分裂畸形的可能性更大。这两个基因属于Wnt信号通路，对于肢体的骨骼发育和形态发生都非常重要[5]。这两个基因的产物可帮助保持AER细胞的增殖活性。动物实验证明，这两个基因同时敲除，可以引起肢体先天畸形[6]。

除单拷贝缺失以外，SHFM1位点染色体易位/倒位或调节元件受到破坏，都是引起肢体缺陷的可能机制。Lo Iacono等[7]发现，DLX蛋白和TP63基因编码的p63转录因子在AER中共存，且p63结合DLX5和DLX6启动子调控其转录。p63活性抑制或受到p63控制的调控元件受到破坏，都会引起Dlx5/Dlx6表达的下调[8]。最近，Shamseldin等[9]对一个常染色体隐性遗传的手足分裂畸形家系展开研究，发现位于同源区的纯合子DLX5错义突变会引起肢体畸型，证明DLX5在人类SHFM1的发病机理中的直接参与作用。

2　SHFM2（Xq26）（OMIM 313350）

到目前为止，X连锁遗传手足分裂畸形家系的报道只有一个[10]，即巴基斯坦的一个近亲婚姻家系，其中有36名成员出现完全的手足分裂畸形（33名男性和3名女性），主要表现为手部单指或双指及典型的分裂足。女性杂合子中约有一半表现出轻微的手和/或足的畸形。核型分析排除了X染色体或常染色体异位。连锁分析将这个家系的致病位点定位到Xq26，即SHFM2[11]。两个定位在该区域的基因FGF13和TONDU可能是致病基因，但目前尚未在手足分裂畸形患者中发现这两个基因的编码突变[12]。

3　SHFM3（10q24）（OMIM 246560）

SHFM3定位在染色体10q24区域，由长度为325～570 Kb的亚微观串联重复导致[13-14]。该位点是手足分裂畸形的最高发突变（约占20%）[15]。定位于该重复区域的基因包括：FBXW4、BTRC、POLL和LBX1。SHFM3以常染色体显性的方式遗传，大部分情况下引起非综合征型典型手足分裂畸形，常伴有肢体内侧畸形（如拇指三节指畸形的或/和复拇畸形）[16]。

Dac小鼠之前被作为人类SHFM3研究的一个动物模型。Dac小鼠带有中间手指缺失，掌/跖骨发育不全以及并指的症状，以半显性方式遗传，即杂合子会表现出前后肢中间手指的缺失，而纯合子则表现出更加严重的先天性单指[17-18]。然而，Dac小鼠致病位点虽位于SHFM3区域，但并非染色体微重复引起，不能完全模拟人类致病机制。

SHFM3致病机制尚不明确。可能的解释有两种，其一是FBXW4转录畸变对野生型等位基因的显性有不良影响，其二是别的发生重复的基因过表达。BTRC作为蛋白质泛素化因子，存在于许多信号传导通路中（如Wnt/β联蛋白、SHH和NF-κB）[19]。这些通路都与肢体发育有关，因此BTRC的表达失调可能与SHFM3显性有量效关系[13]。

4　SHFM4（3q27；TP63）（OMIM 605289）

SHFM4定位在3q27区域，并与TP63基因的突变直接相关[20]。该位点是唯一的常染色体显性遗传的单基因致病位点。TP63基因编码一种转录因子，通过维持外胚层细胞增殖，调节肢芽顶端外胚层脊的形成与分化[21-22]。缺少p63蛋白小鼠无法形成正常的外胚层结构，表现出皮肤、头发、牙齿、颅面骨骼、乳腺和肢体的发育缺陷，例如分裂手或无肢[21-22]。这些小鼠的肢芽由于没有完整顶端外胚层脊，会出现个体无肢现象，这说明p63蛋白对该结构的发生十分重要[20]。

人类的大约10%～16%的散发型手足分裂畸形由TP63变异所导致；另外，93%的EEC综合征（肢体发育不良为主要症状之一）患者的该基因也发生了突变，说明这一位点突变在相关疾病中的具有重要作用[13，23]。

5　SHFM5（2q31）（OMIM 606708）

在一些手足分裂畸形（包括单指/趾畸形）的患者中发现了2q31染色体区域的缺失，这个区域中包含了整个HOXD基因群（HOXD1-HOXD13）[24-26]。 Goodman 等[27]报道了两个患有肢体发育不良病例的家系。第一个家系中，父亲和女儿都带有 HOXD基因 5'端缺失 （HOXD9-HOXD13），并且HOXD13上游只延伸出包括EVX2基因在内的85 Kb区域，引发并多指畸形（SPD）。第二个家系中，先证者患有双侧分裂足畸形，2q31-q33区域缺失，包括完整的HOXD基因群（HOXD1-HOXD13）、EVX2、DLX1 和 DLX2，一直到微卫星标记D2S294（位置在离EVX2大约5 Mb远处）。因此，与EVX2相连的5'端HOXD基因的单倍体不足造成并多指畸形，但不会造成手足分裂畸形；而位于该区域内的DLX1和DLX2这两个基因是分裂手可能的候选基因，这两个基因也都在顶外胚层脊和发育区域中表达。然而，不论是纯合子和杂合子的Dlx1/Dlx2单敲除小鼠，还是Dlx1-/Dlx2-双敲除小鼠，都未发生肢体发育不良[28]。因此，其在手足分裂畸形中的作用尚不明确。

6　SHFM6（12q13；WNT10B）（OMIM 225300）

SHFM6由WNT10B基因纯合突变导致。WNT蛋白是多个信号通路配体，在肢体的形态发生和发育中起主要作用，调控了肌肉、肌腱、骨骼等结构的位置与形态[29]。

Uhur等[30]发现，在Yurkish这个近亲家庭中所有受影响的个体都携带有一个纯合的错义突变（p.R332W）。在另一个常染色体隐性遗传的手足分裂畸形的报道中，一位瑞士患者WNT10B上有一个纯合的4 bp的重复（c.458dupAGCA）[31]。

其余报道中的家系分别出现了WNT10B基因的纯合无义突变（p.T329R）、4 bp 长度的缺失（c.1165delAAGT）和 7 bp长度的重复（c.300dupAGGGCGG）。这些家庭是来自巴基斯坦的4个近亲婚姻的家庭。因此，SHFM6遗传咨询应注重近亲婚姻导致的常染色体隐形遗传疾病的高发[32-33]。

7　其他SHFM位点

伴长骨缺损的手足分裂畸形（SHFLD）一般影响胫骨和腓骨，常伴随17p13.3区域的重复；另有12%不涉及长骨的手足分裂畸形由17p13.3区域的重复所导致。首次报道的病例是一个巴西家族，该家族SHFLD综合征的致病位点被定位到了17p13.1-p13.3的841 Kb的区段。Lezirovitz等[34]将这一区段缩小到BHLHA9单个基因，发现是由该区段重复所致。动物实验确定了这一基因在肢体发育中的功能[15]。与17p13.3区域相关的SHFLD呈现出了明显的与性别相关的外显率降低，大约50%的该区段复制携带者（尤其是女性）未受影响，可能的解释是X染色体上的激素相关元件或调节器因子与17p13.3重复的共同作用，导致了SHFLD的发生[15]。

Aten等[35]报道了一个散发的男性病例，可能由19p13.11染色体区域上的长度为1 Mb的缺失所导致，该区段中EPS15L1基因可能是致病基因。EPS15L1蛋白作为底物参与酪氨酸激酶在上皮生长因子受体中的活动，从而与肢体生长相关联[36]。Bens等[37]在一个患者身上检测到一个与上述拷贝区域部分重合的新型缺失，在一定程度证实了EPS15L1基因是手足分裂畸形的可能基因。

8　诊断与遗传咨询

对手足分裂畸形患者的诊断，需要结合细致的临床检查和相关的基因/分子检查。

如上所述，手足分裂畸形最主要的遗传方式是常染色体显性遗传[4]、常染色 体 隐形遗传[9，31，33，38]和 X 染 色 体连锁的 遗传[10]。散发型手足分裂畸形可能来自于新发生的突变，在这种突变中，先证者的兄弟姐妹的再显率很低，但子女再显率很高，可达30%～50%[31]。考虑到较低的外显率、多样的表型、非孟德拉遗传、偏分离和性别偏倚[15]，还有从患病父亲到儿子的基因选择性传递[39]，都导致手足分裂畸形的家族性遗传和散发病例的遗传咨询变得十分困难且具有挑战性。许多手足分裂畸形由复杂基因突变/染色体畸变的组合导致，是双基因甚至是多基因的障碍，更增加了诊断与基因咨询的困难。因此，手足分裂畸形的遗传咨询必须建立在相关基因的检测上，才能提供有效信息且足够可信。但是，即便患者接受了全部可能致病基因检测，仍可能有基因的缺陷未被了解，这些患者的再显率无法被准确判断，只能通过经验进行预测。

基因检测的顺序可由基因突变出现频率决定。目前，最大的分裂手足患者实验群体有56例病例，其中出现最频繁的基因突变/染色体畸变是 10q24.3（SHFM3）和 17p13.3（SHFM/SHFLD）的亚微观重复，分别占20%和16%[15]。在这一发现的基础上，Sowinska-Seidler等[40]提出手足分裂畸形基因检测可以从10q24和17p13.3的拷贝数变异检测开始。aCGH作为这一检测的工具，不仅能检测出上述变化，而且能检测出其他的非平衡染色体畸变，例如影响到不同区域的亚显微重组（如SHFM1和SHFM5）。此外，aCGH在全部的手足分裂畸形突变位点的检测也可以被数量检测 （例如MLPA和qPCR）替代[6]。另一个重要的分裂手足畸形患者的基因诊断方法是TP63基因的测序。该基因的点突变造成的散发型手足分裂畸形占散发型总病例的10%～16%，且出现新型突变的概率较高。这一突变造成的畸形具有极高的外显率，但是表达较为多样[13]。由于一些手足分裂畸形由较大的染色体畸变造成，常规的染色体核型检测就足够作出诊断，例如7q21-q22（SHFM1）区域[31]的缺失或转位[3，4，41]或者 2q31 区域（SHFM5）的缺失[27，38]。因此，传统的GTG条带检测可用于aCGH之后，主要检测SHFM1和SHFM5位置上的突变，尤其是在SHFM5中常见的合并其他先天异常或者精神迟滞的情况下[41]。而其他已报道的散发性的分裂手足病例 （除小部分的SHFM3）的染色体核型均正常。相对于aCGH而言，染色体核型分析的重要优点是可以检测出染色体的平衡重组 （如在SHFM1中较为少见的易位），且费用较低，因此仍有较大的利用价值。

SHFM6区域包含了WNT10B基因[30]，其变异以常染色体隐形的方式遗传，多为纯合子致病或WNT10B的组合杂合子致病。此外，常染色体隐性遗传的家族型手足分裂畸形，还可由DLX5基因同源域变异的纯合子导致[9]。在隐性遗传的模型中，先证者的兄弟姐妹的再显率为25%，而除非是近亲婚姻，否则子女再显率极低[31]。因此，常染色体隐性遗传的手足分裂畸形十分少见，主要出现在近亲婚姻的家庭中。在诊断的最后可以考虑WNT10B和DLX5基因的测序。在排除了上述所有已知的可能选项后，基因诊断（如全基因组测序/全外显子测序）为一些还未确诊的病例提供了确认机会，从而帮助发现新的手足分裂畸形变异位点（图4）[40]。

图4　基因诊断流程Fig.4　Diagnostic flow-chart of genetic diagnostics

包括aCGH在内的分子诊断技术的发展与应用，使包含手足分裂畸形在内的四肢畸形遗传诊断有了长足进步。确定具体致病基因可以让患者理解疾病原因，并且提供预防或支持措施，为风险评估建立坚实的基础，让相关家庭能进行生育前或移植前的诊断。

[1]Gurrieri F,Kjaer KW,Sangiorgi E,et al.Limb anomalies：Developmental and evolutionary aspects[J].Am J Med Genet,2002,115(4)：231-244.

[2]Tackels-Horne D,Toburen A,Sangiorgi E,et al.Split hand/split foot malformation with hearing loss：first report of families linked to the SHFM1 locus in 7q21[J].Clin Genet,2001,59(1)：28-36.

[3]Crackower MA,Scherer SW,Rommens JM,et al.Characterization of the split hand/split foot malformation locus SHFM1 at 7q21.3-q22.1 and analysis of a candidate gene for its expression during limb development[J].Hum Mol Genet,1996,5(5)：571-579.

[4]Duijf PH,van Bokhoven H,Brunner HG.Pathogenesis of splithand/split-foot malformation[J].Hum Mol Genet,2003,12 Spec No 1：R51-R60.

[5]van Silfhout AT,van den Akker PC,Dijkhuizen T,et al.Split hand/foot malformation due to chromosome 7q aberrations(SHFM1)：additional support for functional haploinsufficiency as the causative mechanism[J].Eur JHum Genet,2009,17(11)：1432-1438.

[6]Robledo RF,Rajan L,Li X,et al.The Dlx5 and Dlx6 homeobox genes are essential for craniofacial,axial,and appendicular skeletal development[J].Genes Dev,2002,16(9)：1089-1101.

[7]Lo Iacono N,Mantero S,Chiarelli A,et al.Regulation of Dlx5 and Dlx6 gene expression by p63 is involved in EEC and SHFM congenital limb defects[J].Development,2008,135(7)：1377-1388.

[8]Kouwenhoven EN,van Heeringen SJ,Tena JJ,et al.Genomewide profiling of p63 DNA-binding sites identifies an element that regulates gene expression during limb development in the 7q21 SHFM1 locus[J].PLoSGenet,2010,6(8)：e1001065.

[9]Shamseldin HE,Faden MA,Alashram W,et al.Identification of a novel DLX5 mutation in a family with autosomal recessive split hand and foot malformation[J].JMed Genet,2012,49(1)：16-20.

[10]Ahmad M,Abbas H,Haque S,et al.X-chromosomally inherited split-hand/split-foot anomaly in a Pakistani kindred[J].Hum Genet,1987,75(2)：169-173.

[11]Faiyaz ul Haque M,Uhlhaas S,Knapp M,et al.Mapping of the gene for X-chromosomal split-hand/split-foot anomaly to Xq26-q26.1[J].Hum Genet,1993,91(1)：17-19.

[12]Vaudin P,Delanoue R,Davidson I,et al.TONDU(TDU),a novel human protein related to the product of vestigial(vg)gene of Drosophila melanogaster interacts with vertebrate TEF factors and substitutes for Vg function in wing formation[J].Development,1999,126(21)：4807-4816.

[13]de Mollerat XJ,Gurrieri F,Morgan CT,et al.A genomic rearrangement resulting in a tandem duplication is associated with split hand-split foot malformation 3(SHFM3)at 10q24[J].Hum Mol Genet,2003,12(16)：1959-1971.

[14]Dimitrov BI,de Ravel T,Van Driessche J,et al.Distal limb deficiencies,micrognathia syndrome,and syndromic forms of split hand foot malformation(SHFM)are caused by chromosome 10q genomic rearrangements[J].JMed Genet,2010,47(2)：103-111.

[15]Klopocki E,Lohan S,Doelken SC,et al.Duplications of BHLHA9 are associated with ectrodactyly and tibia hemimelia inherited in non-Mendelian fashion[J].JMed Genet,2012,49(2)：119-125.

[16]Everman DB,Morgan CT,Lyle R,et al.Frequency of genomic rearrangements involving the SHFM3 locus at chromosome 10q24 in syndromic and non-syndromic split-hand/foot malformation[J].Am JMed Genet A,2006,140(13)：1375-1383.

[17]Johnson KR,Lane PW,Ward-Bailey P,et al.Mapping the mouse dactylaplasiamutation,Dac,and agenethat controlsitsexpression,mdac[J].Genomics,1995,29(2)：457-464.

[18]Sidow A,Bulotsky MS,Kerrebrock AW,et al.A novel member of the F-box/WD40 gene family,encoding dactylin,is disrupted in themousedactylaplasiamutant[J].Nat Genet,1999,23(1)：104-107.

[19]Maniatis T.A ubiquitin ligase complex essential for the NF-kappaB,Wnt/Wingless,and Hedgehog signaling pathways[J].Genes Dev,1999,13(5)：505-510.

[20]Ianakiev P,Kilpatrick MW,Toudjarska I,et al.Split-hand/splitfoot malformation is caused by mutations in the p63 gene on 3q27[J].Am JHum Genet,2000,67(1)：59-66.

[21]Mills AA,Zheng B,Wang XJ,et al.p63 is a p53 homologue required for limb and epidermal morphogenesis[J].Nature,1999,398(6729)：708-713.

[22]Yang A,Schweitzer R,Sun D,et al.p63 is essential for regenerative proliferation in limb,craniofacial and epithelial development[J].Nature,1999,398(6729)：714-718.

[23]van Bokhoven H,Hamel BC,Bamshad M,et al.p63 Gene mutations in eec syndrome,limb-mammary syndrome,and isolated split hand-split foot malformation suggest a genotype-phenotype correlation[J].Am JHum Genet,2001,69(3)：481-492.

[24]Ramer JC,Mowrey PN,Robins DB,et al.Five children with del(2)(q31q33)and one individual with dup(2)(q31q33)from a single family：review of brain,cardiac,and limb malformations[J].Am J Med Genet,1990,37(3)：392-400.

[25]Boles RG,Pober BR,Gibson LH,et al.Deletion of chromosome 2q24-q31 causes characteristic digital anomalies：case report and review[J].Am JMed Genet,1995,55(2)：155-160.

[26]Del Campo M,Jones MC,Veraksa AN,et al.Monodactylous limbs and abnormal genitalia are associated with hemizygosity for the human 2q31 region that includes the HOXD cluster[J].Am J Hum Genet,1999,65(1)：104-110.

[27]Goodman FR,Majewski F,Collins AL,et al.A 117-kb microdeletion removing HOXD9-HOXD13 and EVX2 causes synpolydactyly[J].Am JHum Genet,2002,70(2)：547-555.

[28]Qiu M,Bulfone A,Ghattas I,et al.Role of the Dlx homeobox genes in proximodistal patterning of the branchial arches：mutations of Dlx-1,Dlx-2,and Dlx-1 and-2 alter morphogenesis of proximal skeletal and soft tissue structures derived fromthe first and second arches[J].Dev Biol,1997,185(2)：165-184.

[29]Yang Y.Wntsand wing：Wnt signaling in vertebratelimb development and musculoskeletal morphogenesis[J].Birth Defects Res C Embryo Today,2003,69(4)：305-317.

[30]Ugur SA,Tolun A.Homozygous WNT10b mutation and complex inheritance in Split-Hand/Foot Malformation[J].Hum Mol Genet,2008,17(17)：2644-2653.

[31]Blattner A,Huber AR,Rothlisberger B.Homozygous nonsense mutation in WNT10B and sporadic split-hand/foot malformation(SHFM)with autosomal recessive inheritance[J].Am J Med Genet A,2010,152a(8)：2053-2056.

[32]Khan S,Basit S,Zimri FK,et al.A novel homozygous missense mutation in WNT10B in familial split-hand/foot malformation[J].Clin Genet,2012,82(1)：48-55.

[33]Aziz A,Irfanullah,Khan S,et al.Novel homozygous mutations in the WNT10B gene underlying autosomal recessive split hand/foot malformation in three consanguineous families[J].Gene,2014,534(2)：265-271.

[34]Lezirovitz K,Maestrelli SR,Cotrim NH,et al.A novel locus for split-hand/foot malformation associated with tibial hemimelia(SHFLD syndrome)maps to chromosome region 17p13.1-17p13.3[J].Hum Genet,2008,123(6)：625-631.

[35]Aten E,den Hollander N,Ruivenkamp C,et al.Split hand-foot malformation,tetralogy of Fallot,mental retardation and a 1 Mb 19p deletion-evidence for further heterogeneity[J]?Am J Med Genet A,2009,149a(5)：975-981.

[36]Wong WT,Schumacher C,Salcini AE,et al.A protein-binding domain,EH,identified in the receptor tyrosine kinase substrate Eps15 and conserved in evolution[J].Proc Natl Acad Sci U SA,1995,92(21)：9530-9534.

[37]Bens S,Haake A,Tonnies H,et al.A de novo 1.1Mb microdeletion of chromosome 19p13.11 provides indirect evidence for EPS15L1 to be a strong candidate for split hand split foot malformation[J].Eur JMed Genet,2011,54(5)：e501-e504.

[38]Elliott AM,Reed MH,Roscioli T,et al.Discrepancies in upper and lower limb patterning in split hand foot malformation[J].Clin Genet,2005,68(5)：408-423.

[39]Jarvik GP,Patton MA,Homfray T,et al.Non-Mendelian transmission in a human developmental disorder：split hand/split foot[J].Am JHum Genet,1994,55(4)：710-713.

[40]Sowinska-Seidler A,Socha M,Jamsheer A.Split-hand/foot malformation-molecular cause and implications in genetic counseling[J].JAppl Genet,2014,55(1)：105-115.

[41]Elliott AM,Evans JA.Genotype-phenotypecorrelationsin mapped split hand foot malformation(SHFM)patients[J].Am J Med Genet A,2006,140(13)：1419-1427.

作者声明

本人作为通讯作者在《组织工程与重建外科》杂志2016年第3期上发表的《淋巴管内皮细胞标志物的研究进展》一文，和在2016年第6期上发表的《改良小鼠后肢淋巴水肿模型的构建》一文，均受国家自然科学基金资助，项目编号为81371700和81501571。

特此声明。