罗格列酮对家兔脑出血模型病灶周围内皮素-1表达及血脑屏障通透性的影响

李颖慧，李军，任思颖，王丽琨，伍国锋

在亚洲，脑出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）所有脑卒中类型的20%～30%[1]，发病后1个月的病死率高达40%[2]。ICH后血红蛋白毒性、炎症反应、氧化应激反应等继发性损伤严重损害神经功能[3]。内皮素1（endothelin-1，ET-1）是目前已知的最强、最持久的缩血管活性多肽，其在ICH病理生理中的作用鲜有报道。噻唑烷二酮类药物可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）-γ，抑制炎症反应及氧化应激反应，促进胶质细胞吞噬作用，减轻ICH后继发性损害。罗格列酮为噻唑烷二酮类药物的一种，其减轻下游继发性脑损伤的发生是否与ET-1相关尚不知。本研究探讨罗格列酮病灶区灌注治疗后，血肿周围脑组织ET-1表达及血脑屏障通透性的情况，探讨其减轻ICH后继发性损伤与ET-1的相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验动物 清洁级别健康新西兰大耳白兔45只，由贵州医科大学实验动物中心提供，体质量2.8～3.4 kg，雌雄不拘，在光照充足，10℃～30℃环境饲养。

1.1.2 主要仪器及试剂 ZH-蓝星B型兔脑立体定位仪购于淮北正华生物仪器设备有限公司；台式高速离心机Eppendorf 5415D购于德国Eppendorf公司；SynergyH4酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司；ET-1单克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；ET-1二抗、DAB显色试剂盒购于中山公司生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 45只家兔随机分为3组，正常对照组（NC组）、模型组（MC组）、药物灌注组（RSG组），各15只。每组在制模后1、3或7 d各处死5只家兔行相关指标测定。

1.2.2 模型及标本制备方法 造模前12 h禁食，6 h禁饮。家兔麻醉后固定在立体定位仪上，取十字缝与人字缝交叉点为0点，于AP0/L6为穿刺点，深度约12 mm。NC组缓慢注入生理盐水0.3 mL，MC组及RSG组注入家兔耳中央动脉血0.3 mL，留针10 min后缓慢拔出；6 h后NC组及MC组再次缓慢注入生理盐水0.1 mL，RSG组注入含有罗格列酮0.2 mg/kg的生理盐水0.1 mL，留针10 min后缓慢拔出。模型制备完成后肌注40万单位青霉素预防感染。家兔在处死前2 h行Purdy神经功能评分，耳缘静脉注入2%伊文思蓝（2 mL/kg）。行心脏灌洗生理盐水及中性甲醛固定脑组织，取脑后置于冰盘，将针道中心直径1.5 cm以外的脑组织切除，四分法切割后用于检测。

1.2.3 免疫组织化学检测 取兔脑组织制作石蜡切片，片厚3 μm，常规法行免疫组化染色，小鼠ET-1作为一抗（1∶120），山羊抗鼠IgG抗体-HRP为二抗，DAB显色。细胞膜或细胞质中出现棕黄色物质者为ET-1阳性细胞。MIAS图像分析系统测定阳性细胞的平均光密度值，400倍视野下每张切片选择5处阳性细胞测定其平均光密度值。

1.2.4 血脑屏障通透性检测 将4 mg伊文思蓝融入100 mL生理盐水中，加入甲酰胺配成溶液浓度分别为8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。加入64孔板中，放入酶标仪，在632 nm处作出标准曲线。精确称取脑组织湿重3次取平均值并记录，浸泡入4 mL甲酰胺溶液中，恒温水浴箱54℃水浴24 h后，2 400转/分离心5 min，取上清液加入64孔板中，632 nm处检测吸光度。利用标准曲线线性回归方程y=0.0053x+0.0608(R=0.9899)计算出样本的伊文思蓝含量（B值），然后测出脑组织伊文思蓝含量=B×甲酰胺容积(mL)/湿重(g)。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件处理数据。计量资料以（±s）表示，符合正态分布且Levene检验方差齐同，组间比较采用方差分析；若数据不服从正态分布或方差不齐同则行近似F检验或非参数秩和检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Purdy评分变化

NC组在各时间点均未见明显神经损害；MC组在各时间点均出现显著神经功能损害，第3天最明显；与MC组比较，RSG组各时间点神经功能均有改善，见图1。

2.2 各组ET-1表达情况

NC组ET-1在不同时间表达稳定，水平较低；与NC组比较，MC组及RSG组ET-1表达显著升高，MC组ET-1表达在第1天即显著升高，第3天达高峰，第7天开始明显下降；与MC组比较，RSG组在相同时间点ET-1表达均显著下降；见图2、3。

2.3 各组脑组织伊文思蓝含量比较

图1 各组不同时间Purdy评分比较

图2 各组不同时间ET-1表达情况比较

图3 各组不同时间血肿周围脑组织ET-1表达（×400）

NC组脑组织伊文思蓝含量稳定在较低水平；与NC组比较，MC组在各时间点伊文思蓝含量均显著升高，表明MC组血脑屏障通透性显著增加，其中第3天增加最明显；与MC组比较，RSG组伊文思蓝含量降低，表明罗格列酮病灶区灌注治疗对血脑屏障有保护作用；见图4。

2.4 ET-1表达水平与血肿周围脑组织伊文思蓝含量及Purdy神经功能评分相关性分析

血肿周围脑组织ET-1表达水平与伊文思蓝含量及Purdy评分均呈显著的正相关，见图5。

3 讨论

图4 各组不同时间伊文思蓝含量比较

图5 ET-1表达水平与血肿周围脑组织伊文思蓝含量（A）及Purdy神经功能评分（B）相关性分析

研究表明，脑内血肿的发生发展在ICH后的继发性损害发挥重要作用[3,4]。ICH后破入脑实质的红细胞及其裂解产物血红素分别通过与局部的小胶质细胞细胞膜上的CD36受体和Toll样受体4结合，激活小胶质细胞，一方面增强其吞噬作用，另一方面激活细胞内核因子κB（NF-κB），促进促炎介质及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达，促进炎症反应及血脑屏障的破坏[4-7]，加重脑损害。缺血性脑损伤研究中证实活性氧物质可以激活PI3K/Akt、MAPK/P38、NFPK通路介导细胞凋亡[8]；在ICH的研究中也表明，氧自由基可以导致脑细胞凋亡增加[9,10]，但具体机制尚不明确[11]，可能与 PKC/CK2[12]、ERK[13]、JNK[14]、细胞色素C[15]、MMP-9[15,16]等信号通路有关。

ET-1是由21个氨基酸构成的血管活性多肽链，是目前已知的最强、最持久的缩血管活性多肽。内皮素不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。ET-1与NO的平衡对保持正常血管内皮功能起到重要作用。ET-1合成释放增加，导致血管内皮功能障碍，参与高血压、II型糖尿病、肾病、肺动脉高压、缺血再灌注损伤等多种病理生理过程。ET-1有2种受体分别为ETA和ETB受体，均为G蛋白偶联受体。在生理状态下，脑组织星型胶质细胞几乎不表达ET及受体，但在受到脑缺血、脑外伤、脑炎等病理损害时，星型胶质细胞可以表达ET-1、ET-3、ETA及ETB等内皮素系统所有成分[17,18]。对胶质细胞的体外研究表明，ET-1可激活G蛋白偶联受体ETB，使细胞质内酪氨酸激酶磷酸化，通过P13K/AKt及p42/p44MAPK通路激活转录因子NF-κB，促进炎症介质的产生、iNOS表达及NO合成，NO通过硝化酪氨酸激活MMP-9[19]，进而破坏血脑屏障结构而加重脑水肿[20]。

PPAR-γ是位于细胞核核膜上的转录因子，当其被激活后与视黄酸受体形成异源二聚体调控目的基因的转录[23]。PPAR-γ激活后可抑制NF-κB激活，从而减轻血肿周围脑组织的炎症反应[23]；PPAR-γ通过激活NrF2通路和促进过氧化物酶、超氧化物歧化酶的表达，减轻ICH后氧化应激反应[5,24,25]。本课题组前期研究表明，ICH后血肿周围组织ET-1表达增加，微创血肿清除治疗可降低ET-1表达并减轻ICH后的继发性损害[21,22]。本研究表明，ICH后ET-1表达增加，给予罗格列酮灌注治疗后血肿周围脑组织ET-1表达降低，血脑屏障通透性降低，预后显著改善，由此推测罗格列酮可能通过作用于ET-1，进而影响下游的变化。

综上所述，ICH后血肿周围脑组织ET-1表达及血脑屏障通透性增加，血肿周围脑组织ET-1的表达水平与血脑屏障通透性及神经功能损害程度存在相关性。罗格列酮病灶区灌注治疗可降低血肿周围脑组织ET-1表达及血脑屏障通透性，推测罗格列酮可能部分通过降低ET-1的表达减轻ICH后的继发性损伤，为进一步的研究及临床应用提供基础。

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