西部煤炭资源地下开采对不同坡位柠条光合系统损伤特征分析

王　丽，雷少刚，卞正富

(1 中国矿业大学 环境与测绘学院，江苏徐州 221116；2 滁州学院 地理信息与旅游学院，安徽滁州 239000)

地下开采引发地表沉陷和裂缝[1-2]，改变地表形态[3]，导致光照、水分、土壤养分等植被生境变化[4-6]，最终影响植物个体生长和群落的空间分布[7-9]。目前关于中国半干旱矿区采煤塌陷对植物的影响研究已经引起广大学者的关注，如赵国平等研究表明采煤塌陷导致植被的死亡率增大[10]；赵欢欢等研究发现采煤塌陷区优势种发生演替，即由多年生草本植物演变为一二年生草本植物[7]等。迄今，已有研究主要集中在景观尺度和群落尺度，如：钱者东等研究指出煤炭开采造成矿区植被生物量减少、景观斑块形状复杂化、破碎度加大[11]；黄翌等利用遥感技术分析了大同矿区煤炭开采对植被扰动的时空效应[12]；郭友红研究发现，与非采区相比，采煤沉陷区植物多样性有所增加[13]。但到目前为止，基于微观尺度研究煤炭开采对植物个体光合生理影响的研究较为少见。光合作用是植物物质积累的重要途径，植物光系统性能直接影响植物生长速度及形态[14]。采煤沉陷区内植物通过调节自身光合生理过程，改变形态特征等，以适应外界环境胁迫的影响[15]。因此，可以通过植物叶片光合作用的变化来反映植物对环境因子的适应性及其对各种环境资源的利用能力[16]。

叶绿素荧光技术是快速检测逆境胁迫对植物叶片光系统影响的无损探针[17-18]。该技术已被广泛应用到诸如干旱[19]、环境污染[20]、光照[20]、营养元素亏缺[21]、高/低温[22-23]等逆境胁迫对光系统原初反应的影响研究中[18]。利用Strasser等基于生物膜能量流构建的JIP测定方法[24]，还可以进一步检测植物叶片PSⅡ氧化-还原状态及色素间的能量传递变化[25]。应用该技术方法分析煤炭开采后植物叶片光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配的变化特征，可以快速和非破坏性地反映采煤对植物光合系统功能的影响。

本研究以神东矿区为研究区域，选取区域优势物种柠条为实验材料，应用快速叶绿素荧光诱导动力学理论及技术方法，分析采煤塌陷后柠条叶片光系统对逆境的响应特征，识别影响柠条光合生理活动的关键环境因子，为西部矿区植物个体损伤诊断与修复提供方法参考。

1　材料和方法

1.1　研究区概况与样地设置

神东矿区(110° 05′～118° 14′E，39° 17′～39°26′N)，北临毛乌素沙地，南接黄土高原，地处风沙地貌向黄土丘陵地貌的过渡带。气候属温带大陆性气候，年平均气温8 ℃，年蒸发量2 000 mm左右，年平均降水量350 mm左右。植被类型为暖温带典型草原区，原生代表群系为针茅草原。矿区煤炭资源具有埋藏浅、基岩薄、煤层厚的特点，以综合机械化采煤为主要采煤方法，工作面多为长度大于200 m超大工作面。相关研究表明超大工作面开采显著增加了采后地表稳定下沉区的面积和范围，同时采煤对上覆岩层与地表的扰动程度比一般采煤工作面更为剧烈[26-28]，因此对植被影响也更为显著。

本研究分别在非采区(作为对照，CK)及开采沉陷后1 a、2 a的工作面(图1)正上方，选取区域优势物种柠条(Caraganakorshinskii)为目标植物，选取海拔、坡度、坡向及土壤类型相近的坡地作为研究样地，并于各样地不同部位(坡上、坡中、坡下)分别设立3个5 m×5 m样方，取样测定相关指标。

图1　研究区域及样方位置图Fig.1　Geographic sketch maps of study area and samples

1.2　测定指标及方法

1.2.1快速叶绿素荧光诱导动力学曲线2016年7月上旬，选择天气晴朗的上午7:00～9:00，在每个样方内选取5株长势较一致的柠条作为目标植物，对目标植物健康成熟叶片进行暗适应(20 min)，利用OSP330+便携式叶绿素荧光仪，测定各叶片的O-J-I-P曲线，荧光诱导曲线用于JIP-test分析。

OJIP曲线由3 000 μmol/(m-2·s-1)脉冲红光诱导，荧光信号的记录从10 μs(以0 ms计算)开始至1 s结束，共记录105个数据，OJIP曲线上O、K、J、I和P点分别为0、0.13、2、30和1 000 ms对应的时刻[29]。利用5次重复的平均值绘制OJIP曲线，曲线横坐标以对数形式表示[30-31]。为消除荧光振幅之间的差异，利用公式对OJIP曲线进行标准化处理，将F值转换为对应的V值，标准化公式为[32]：Vop=(Ft-Fo)/(Fp-Fo)，其中Vop为标准化后的相对荧光强度，Ft为各时间点的荧光强度，Fp为对应P相点的荧光强度[33]。然后计算相对荧光变幅[34]，计算公式为：ΔVop=Vop(t)-Vop(ck)，其中t为沉陷年限，CK为作为对照的非采区。

1.2.2JIP-test分析O-JIP协议(JIP-test)是Strasser等在生物膜能量流动理论基础建立的分析方法[35]。利用该方法能够获取大量有关叶片PSⅡ进行原初光化学反应过程中能量传递效率的信息[18]。对OJIP曲线进行JIP-test分析，可得到以下荧光参数：(1)供体侧参数：Wk(K相可变荧光占J相可变荧光的比例，反映放氧复合体损伤程度)[29]；(2)反应中心参数：单位反应中心吸收(ABS/RC) 、捕获(TRo/RC)、用于电子传递(ETo/RC)的能量及反应中心密度(RC/CSo)、单位面积热耗散的能量(DIo/CSo)[34]；(3)受体侧参数：Vj( J点相对可变荧光)、Mo(QA的初始还原速度)；(4)光合性能指数：Fv/Fm(PSⅡ最大光化学效率)、PIABS(以吸收光能为基础的光合性能指数)等。对上述荧光参数，以对照组CK的叶绿素荧光参数为标准，求得采煤沉陷区柠条与对照(CK)组柠条叶绿素荧光参数的比值[30, 36]，绘制雷达图。

1.2.3土壤理化性状在进行柠条叶绿素荧光和光合呼吸监测的同时，用密封袋同步在样方内随机采集表层0～15 cm土壤样品，土样带回实验室分析土壤化学性质(每个样方5个重复，用四分法处理后作为一个混合土样)。其中，土壤含水量测定采用烘干法，有机质含量测定采用容量法，全氮含量测定采用凯氏定氮法，速效氮含量测定采用碱解扩散法，全磷含量测定采用酸溶钼锑抗比色法，速效磷含量测定采用NaHCO3浸提钼锑抗比色法，全钾含量测定采用HF消解火焰光度计法，速效钾含量测定采用NHQCOOH浸提火焰光度计法[37]。

1.3　数据处理

采用Excel 2013软件对基础数据进行初步统计分析；利用SPSS 22软件对数据进行多元因变量方差分析(multivariate analysis of variance，MANOVA)，采用最小显著差数法( LSD法)进行多重比较和显著性检验(α=0.05)，绘制OJIP曲线及雷达曲线；利用Canoco 5.0 软件对柠条荧光参数与环境因子指标进行蒙特卡罗检验和冗余分析(redundancy analysis, RDA)。

2　结果与分析

2.1　采煤塌陷对土壤物理化学性质的影响

研究区土壤以风沙土和硬梁土为主，土壤结构较疏松，抗蚀性能差，土壤养分总体特征表现为缺磷、少氮、富钾，土壤偏碱性(表1)。 整体来看，不同坡位采煤沉陷后土壤pH值、全氮、全磷与全钾含量差别不大，土壤养分差异主要体现在土壤水、速效磷、速效钾含量及其变化规律不同。具体表现在：(1)坡上：土壤水含量持续减少，速效氮和速效磷含量均持续增加，速效钾含量先减少后增加；(2)坡中：土壤水含量先增加后减少，速效氮、速效磷和速效钾含量均先减少后增加；(3)坡下：土壤水含量持续减少，速效氮和速效钾含量均先减少后恢复，速效磷含量持续增加。

2.2　采煤沉陷对柠条叶片OJIP曲线的影响

依据OJIP曲线变化可以从整体上判断采煤沉陷对柠条PSⅡ的影响状况。典型快速叶绿素荧光诱导动力学曲线有O、J、I、P 等相[38-39]。叶片PSⅡ供体受到伤害时，在J点之前叶绿素荧光强度会上升即出现K点(300 μs 处)，多相荧光相应由O-J-I-P转变为O-K-J -I-P[40]。本研究发现采煤沉陷后不同年限、不同坡位样地柠条叶绿素荧光动力学曲线(Ft)均呈现OKJIP五相型，即出现K点(图2, A～C)，表明在区域干旱环境下柠条PSⅡ供体侧受到抑制，放氧复合体(OEC)失活[38]。

同时，分析标准化后OJIP曲线(Vop)可以更准确地反映相对荧光强度变化特征。其中，坡上不同沉陷年限间标准化曲线差异最明显，即相对荧光强度变化最大，而坡中和坡下不同沉陷年限区域相比对照区差异不明显(图2，D～F)。另外，进一步分析ΔVop曲线变化(图2，G～I)可知:(1)坡上部位：沉陷1 a后柠条ΔVop曲线ΔK-band(K带)和ΔJ-band(J带)均大于0，表明PSⅡ供体侧放氧复合体(OEC)受损导致失活，QA-有大量积累；同时，ΔI-band(I带)大于0又表明QB2-合成减少，PSⅡ受体侧QA与QB之间的电子传递受到严重抑制；沉陷2a后柠条ΔVop曲线K带、J带略大于零，I带小于0，表明PSⅡ受损后逐渐恢复(图2，G)。(2)坡中部位：沉陷1a后柠条ΔVop曲线K带和J带小于0，I带略大于 0，表明PSⅡ供体侧放氧复合体未受影响，而QA与QB之间的电子传递受到轻度抑制；沉陷2 a后柠条ΔVop曲线K带、J带和I带均小于0，表明PSⅡ受损后逐渐恢复(图2，H)；(3)坡下部位：沉陷1 a后柠条ΔVop曲线K带、J带和I带均大于0，PSⅡ供体侧放氧复合体受损，受体侧电子传递受到抑制；沉陷2 a后柠条ΔVop曲线K带和J带大于0，I带小于0，说明PSⅡ供体侧放氧复合体受损仍未完全恢复，受体侧电子传递恢复到CK状态(图2,I)。

表1　采煤区塌陷后样地土壤物理化学性质的变化

注：CK表示对照组；1 a表示沉陷后1年；2 a表示沉陷后2年；下同

Note: CK stands for the control group; 1 a mean 1 year after subsidence; 2 a indicate 2 years after subsidence; The same as below

图2　采煤区沉陷后样地柠条叶片O-JIP曲线的变化Fig.2　The O-JIP curve of Caragana korshinskii leaves after coal mining subsidence

图3　不同样地柠条叶片JIP-test参数雷达图Fig.3　Radar plot of JIP-test parameters of Caragana korshinskii leaves in different places

2.3　采煤沉陷对柠条叶片JIP-test参数的影响

将JIP-test获取的相关参数绘制雷达图，比较分析各参数的变化，可以进一步量化采煤沉陷后柠条PSⅡ反应中心、供体侧、受体侧等不同功能部位的变化情况[41](图3)。

2.3.1PSⅡ供体侧变化采煤沉陷后不同坡位柠条叶片PSⅡ供体侧变化特征如下：(1)坡上柠条Wk在沉陷1 a后比CK增加74.54%，而在沉陷2 a后却比CK下降2.5%，即沉陷1 a后坡上柠条PSⅡ供体侧受环境胁迫受损，放氧复合体(OEC)失活，沉陷2 a后坡上柠条PSⅡ供体侧基本恢复到CK状态；(2)坡中柠条Wk在沉陷1 a、2 a后分别比CK下降3.39%和3.72%，表明坡中位置供体侧受沉陷影响不大；(3)坡下柠条Wk在沉陷1 a、2 a后分别比CK增加48.22%和1.63%，表明坡下位置供体侧受损、OEC失活且尚未完全恢复。

2.3.2PSⅡ反应中心变化比活性参数可以定量反映柠条PSⅡ反应中心对光能的吸收、转化和耗散等状况。(1)坡上柠条ABS/RC、TRo/RC、DIo/CSo和RC/CSo在沉陷1 a后分别比CK增加18.16%、41.62%、49.75 %和4.01%，在沉陷2 a后则分别增加4.26%、6.05%、28.74%和19.52%，但其柠条ETo/RC在沉陷1 a和2 a后却分别比CK下降了13.20%和5.75%。(2)坡中柠条ABS/RC、TRo/RC、DIo/CSo和ETo/RC在沉陷1 a后分别比CK下降12.56%、7.21%、4.49%和21.13%，而RC/CSo比CK增加6.74%；其柠条ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC和RC/CSo在沉陷2 a后比CK分别下降11.70%、19.78%、16.05%和0.6%，而DIo/CSo增加了8.32%。(3)坡下柠条ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/CSo和RC/CSo在沉陷1a后分别比CK增加21.25%、46.44%、7.53%、25.43%和4.04%；其柠条ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC和DIo/CSo沉陷2 a后分别比对照增加2.35%、14.27%、2.62%和37.03%，而RC/CSo比对照下降13.76%。上述结果表明：(1)采煤沉陷后坡上柠条PSⅡ反应中心吸收、捕获和用于热耗散光能增加，反应中心密度增大，而用于电子传递的能量减少；(2)采煤沉陷后坡中柠条PSⅡ反应中心吸收、捕获和用于电子传递光能均减小，同时沉陷后1～2 a柠条PSⅡ反应中心用于热耗散光能先减少后增加，反应中心密度先增加后减少；(3)采煤沉陷后坡下柠条PSⅡ反应中心吸收、捕获、用于电子传递和热耗散的光能均增加，但沉陷后1～2 a柠条PSⅡ反应中心密度先增加后减小。

2.3.3PSⅡ受体侧变化从电子受体所处状态可以看出：(1)坡上柠条PSⅡ受体侧Vj和Mo在沉陷1 a后分别比对照增加76.97%和89.13%，在沉陷2 a后则分别比对照增加13.65%和9.23%；(2)与对照相比，坡中柠条PSⅡ受体侧Vj和Mo在沉陷1 a后分别增加21.00%和4.03%，在沉陷2 a后则分别减少5.09%和21.11%；(3)坡下柠条PSⅡ受体Vj和Mo在沉陷1a后分别比对照增加76.97%和89.13%，在沉陷2 a后分别增加8.78%和38.88%。可见，采煤沉陷后坡上和坡下柠条PSⅡ受体侧参数Vj和Mo等因逆境胁迫而增加，即逆境胁迫使PSⅡ受体侧功能发生改变，电子传递链受到了抑制，并随胁迫减小逐渐减轻；而坡中柠条受体测功能仅受轻度抑制并很快恢复。

2.3.4PSⅡ整体性能变化不同坡位柠条PSⅡ整体性能在采煤沉陷后发生变化不尽相同。(1)坡上柠条Fv/Fm和PIABS在沉陷1 a后分别比对照下降7.50 %和66.67%，而在沉陷2 a后分别下降6.6%和41.93%；(2)坡中柠条Fv/Fm在沉陷1 a和2 a后分别比对照下降1.90%和5.77%，PIABS分别比对照增加2.02和3.07%；(3)坡下柠条Fv/Fm和PIABS在沉陷1 a后分别比对照下降0.55%和44.08%，在沉陷2 a后分别下降5.58%和38.88%。可见，采煤沉陷后坡上和坡下柠条PSⅡ发生了光抑制，系统性能下降，而坡中柠条光系统受胁迫影响不大。

2.4　采煤沉陷区影响柠条PSⅡ的关键环境因子分析

采煤沉陷区柠条荧光参数的变化归根结底是环境因子制约的结果。本研究初步筛选土壤水、pH、有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾含量作为环境影响因子(表1)，在此基础上利用前向检验，剔除未通过检验的土壤全氮、全磷、全钾、速效磷和有机质含量等因子，最终选取土壤水、pH、速效磷和速效钾作为主要影响环境因子，结合荧光参数应用RDA排序方法进行梯度分析。结果表明：前2个排序轴对荧光参数-环境间关系的累计贡献达82.98%(表2)，包含的信息较大，显示出重要的生态意义，因此采用第一、第二排序轴绘制荧光参数-环境因子的二维排序图，同时第一轴和前四轴排序均通过蒙特卡罗置换检验(Monte Carlo permutation test)，即P值均小于0.005(表2)，达到极显著水平。同时，从表3可以看出，第一轴主要反映土壤水和速效磷的梯度变化，即沿横轴从左向右土壤水和速效磷含量逐渐增加；第二轴主要反映土壤水和pH梯度变化，即沿纵轴从下到上土壤水含量和pH值逐渐增加。另外，依据环境因子向量与荧光参数向量间的关系(图4)，同时结合单因素方差分析(图5)，识别限制各荧光参数的关键环境因子：(1)PIABS与第一轴几乎完全重合，主要受到土壤水和速效磷的影响；Fv/Fo与土壤水和土壤速效钾显著正相关；(2)Vj和Mo与土壤速效磷显著正相关；(3)ABS/RC和DIo/CSo与土壤速效钾显著负相关；(4)RC/CSo与第二轴几乎完全重合，即主要受土壤水和pH的影响；(5)ETo/RC主要受到土壤pH的制约。

表2　荧光参数RDA排序分析特征值

3　讨　论

叶绿素荧光是衡量植物逆境胁迫程度的无损探针[42]，已有学者利用叶绿素荧光动力学方法研究了干旱区不同植物荧光差异性[43]及其对全球气候变化的响应[44]，但基于微观尺度研究西部煤炭地下开采对特定植物的损伤过程与修复规律的报道还较为少见。有鉴于此，本研究应用叶绿素荧光动力学技术对神东采煤塌陷区不同坡位柠条光系统损伤特征及适应机制进行了初步探索，研究过程中仍存在一些问题有待进一步讨论。

实线箭头连线表示环境因子；虚线箭头连线表示荧光参数指标；环境因子与荧光参数指标箭头连线之间的夹角大小代表两者之间相关性的大小，且夹角越小相关性越大图4　柠条荧光参数-环境变量RDA双序图The solid arrow line indicating environmental factors; The dotted arrow line indicating fluorescence parameters; The size of the angle represents the correlation between the environmental factors and the fluorescence parameters. The smaller the angle is, the greater the correlation isFig.4　Biograph of fluorescence parameters-environmental factors from RDA

排序轴Axis第一排序轴Axis1第二排序轴Axis2第三排序轴Axis3第四排序轴Axis4土壤水Soilwater0.57160.4815-0.4031-0.1091酸碱度pH-0.28950.3505-0.84360.0441速效钾Availablepotassium-0.31040.21950.8977-0.0019速效磷Availablephosphorus0.50190.10090.8160-0.0159

不同小写字母表示各坡位沉陷年限间在0.05水平上存在显著性差异图5　采煤区沉陷后主要环境因子的变化The different normal letters indicate significant difference among different subsidence years at 0.05 levelFig.5　The main environmental factors after mining subsidence

叶绿素荧光诱导动力学曲线可以反映逆境对植物光化学作用的影响[45]。本研究发现，与正常生境下快速荧光诱导曲线“O-J-I-P”四相型相比，西部矿区非采区和采煤沉陷区柠条叶片快速荧光诱导曲线整体均呈现“O-K-J-I-P”五相型特征, 表明即使在非开采的情况下，柠条也受到外界环境胁迫。结合相关研究分析认为，产生这一现象的原因主要是西部矿区蒸发量远高于降水量，干旱缺水抑制了水裂解系统和QA前受体侧部分，损伤了放氧复合体(OEC)从而出现了K点[46]。标准化后OJIP曲线(Vop)显示采煤沉陷1 a后坡上和坡中均出现了K带、L带和I 带，主要是采煤沉陷后区域环境变化改变了柠条叶片类囊体膜流动性，导致PSⅡ功能和结构受到破坏[47]。

本研究基于能量流对采煤沉陷区不同坡位柠条叶片PSⅡ 各功能部位的分析表明，不同坡位的柠条受到的损害程度不同，相应的适应机制也不同。坡中柠条受到的外界环境胁迫较小，叶片PSⅡ反应中心启动保护机制，即部分反应中心可逆性失活，通过“非QA还原反应中心”(反应中心不还原QA，也不把激发能传回天线色素)和“非QB还原反应中心”(反应中心仅结合QA但不结合QB)形成能量陷阱[48]，吸收光能但不传递能量，当逆境胁迫减轻或消除后，失活的反应中心也重新恢复活性[49]。坡上、坡下柠条PSⅡ受损严重，环境胁迫下柠条PSⅡ反应中心通过耗散过剩的激发能减轻伤害[50]。

大量研究表明逆境胁迫会抑制植物PSⅡ活性，产生光破坏，严重时导致植物整株死亡[51]，而Fv/Fm(PSⅡ原初光能转换效率)能有效表征逆境对植物胁迫程度[52]。然而本研究结果表明，虽然采煤沉陷区不同坡位柠条叶片Fv/Fm平均值为0.75，低于相关研究的0.80～0.85[53]，但不同坡位柠条Fv/Fm差异不明显，即Fv/Fm对坡位间环境胁迫敏感性较差，研究结论与王振兴[54]等研究结果相一致，这可能是由于采煤沉陷区逆境胁迫条件下柠条PSⅡ光合系统启动了相应的适应机制，结果使Fo和Fm两者变化趋势相同所致[55]。本研究同时发现，相比Fv/Fm，PIABS对采煤沉陷区不同坡位差异更为敏感。这是因为PIABS是以吸收光能为基础的光合性能指数，由RC/ABS、φPo和ψo3个独立参数综合确定，能够从能量吸收、捕获及电子传递 3 个角度全面反映光PSⅡ的活性[55]，因此可以更准确地反映采煤沉陷区逆境胁迫变化。

已有研究表明半干旱气候条件下，干旱缺水是抑制西部矿区植被生长的主要原因[56]，煤炭地下开采进一步造成土壤水分亏缺[5]及速效养分流失[57]。本研究RDA排序分析表明土壤水和速效磷是采煤塌陷区限制不同坡位柠条光化学反应的主要因素，进一步印证了上述研究结论。同时，本研究结果显示柠条Fv/Fm与土壤水显著相关，而丁龙等研究表明土壤逐步干旱过程中植物Fv/Fm有所降低[43]，朱从桦等[58]研究也表明低磷胁迫下植物叶片PSⅡ反应中心开放程度、光能捕获能力和电子传递效率均会下降，同时热耗散能力明显增强，本研究结果均与这些研究结果一致。

综上所述，目前叶绿素荧光技术虽然已经被广泛应用于植物逆境胁迫研究，但多用于室内受控试验，植物往往在短期内遭受单因子、高强度胁迫，而在西部采煤塌陷区自然环境中，柠条同时受到多重环境因子的综合影响，实际情况更为复杂。本研究对叶绿素荧光技术应用于野外原位观测做了初步尝试，结果表明叶绿素荧光参数能够提供丰富的植物PSⅡ原初光化学反应信息，可以用于快速、无损伤地诊断西部矿区柠条PSⅡ损伤状况。该研究弥补了微观尺度研究的不足，研究结果可为基于个体尺度的矿区植被损伤诊断提供方法参考，同时针对不同坡位柠条PSⅡ损伤与自修复存在空间异质性的特点，在矿区植被恢复时应适时进行分区差异性修复。

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