白番红花CrCBF1基因的克隆及功能分析

张克闯，杨红兰，李小双，张道远*，王玉成

(1 中国科学院新疆生态与地理研究所 干旱区生物地理与生物资源重点实验室，乌鲁木齐830011；2 中国科学院大学，北京100049)

白番红花(CrocusalatavicusRegel et Sem.)属鸢尾科(Iridaceae)番红花属(CrocusL.)药用植物，产于中国新疆伊犁河谷，中亚也有分布，生于海拔1 200～3 000 m的寒冷山坡及河滩草地[1]。常形成层片或小群落。本种花白色，可作园林早春花卉，新疆民间用球茎作药用[1-2]。属多年生早春类短命植物，能在积雪覆盖下完成开花结实，具有极强的抗寒性[2]。

CBFs/DREB1蛋白(C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factors 1)属于AP2/EREBP家族转录因子[3]。在逆境条件下CBFs/DREB1蛋白能有效地与CRT/DRE(C-repeat /dehydration responsive element)脱水响应元件结合，并激活其下游COR(cold-regulated)基因的转录，提高植物抵抗低温、干旱以及高盐等非生物胁迫的能力[4]。1997年首次从拟南芥中克隆得到CBF1/DREB1B转录因子，并证明其参与拟南芥的抗冷信号通路[5]。CBF1转录因子虽然是在拟南芥中发现的，但研究表明，CBF冷反应信号通路的各个组成因子在开花植物中高度保守。近些年来在不同的物种中均证明CBF1基因参与植物的冷调控，如水稻[6]、胡杨[7]、葡萄[8]、桑树[9]、苹果[10]、大豆[11]、棉花[12]、玉米[13]、短柄草[14]等植物中均证明CBF1基因参与抗冷调控。但上述研究多见于重要的经济作物及经济果木中，有关野生的、抗寒性强的(类)短命植物中CBF1基因却鲜见详细研究。本研究首次克隆得到多年生早春短命类植物白番红花CrCBF1基因序列，在对CrCBF1的基因特性进行研究的同时，通过酵母功能验证发现在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1中过表达CrCBF1基因可以提高重组酵母的抗寒性，初步验证CrCBF1基因参与冷调控信号通路。

1　材料和方法

1.1　实验材料

实验材料为野生白番红花，采自新疆新源县(82°15′ E，43°29′ N)，材料连同根系土壤一并带回实验室，洗净、去土液氮冷冻，放入-80℃超低温冰箱保存。

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株、酵母Y2H菌株、酵母自激活阳性对照菌株、农杆菌EHA105菌株、酵母表达载体pYES2及pGBKT7、亚细胞定位载体pBI121-GFP均由本实验室保存；植物组织总RNA提取试剂盒Plant RNA Kit、质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit及琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒Gel Extraction Kit均购自OMEGA公司；反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA Marker 2000、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态、载体连接试剂盒pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit均购自北京全式金公司；引物合成及序列测定由北京华大基因有限公司完成。

1.2　总RNA的提取和cDNA的合成

取0.1 g白番红花叶片材料(-80 ℃超低温冰箱保存)，利用Plant RNA Kit试剂盒提取总RNA，提取的RNA用NanoDrop 2000检测，利用1%凝胶电泳检测RNA质量。选择A260/A280值在1.9到2.1之间，质量浓度大于200 ng·μL-1且条带清晰的RNA用于反转。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反转试剂盒进行总RNA的cDNA反转录,合成第一链cDNA。

1.3　白番红花CrCBF1基因的克隆

根据NCBI已发表的鸢尾科植物马蔺[IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.]的IlCBF1基因序列(GenBank登录号DQ131497)设计特异性引物CrCBF1-F/R(表1)。以cDNA为模板，使用TaKaRa Ex Taq RR001聚合酶进行PCR扩增，扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测并回收，产物纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落摇菌，菌液PCR鉴定阳性菌株测序。

1.4　白番红花CrCBF1基因的生物信息学分析

根据CrCBF1基因的cDNA序列，利用NCBI的ORF finder工具寻找开放阅读框，再将ORF序列翻译成氨基酸序列。利用ExPASy网站的ProtParam工具计算CrCBF1蛋白的理论分子量、等电点等基本参数。利用NCBI CDD工具分析序列的结构域及功能元件。利用MEGA5.0软件通过邻近法构建蛋白系统进化树。利用Phyre2分析CrCBF1蛋白的二级及三级结构。

1.5　白番红花CrCBF1蛋白亚细胞定位分析

构建pBI121-CrCBF1-GFP融合植物表达载体，利用SmaI限制性内切酶把环状pBI121-GFP载体切成线状。设计引物CrpBI121-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物回收，利用pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒，把目的基因片段连入pBI121-GFP线性载体，构建pBI121-CrCBF1-GFP重组载体。转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落，PCR检测为阳性的菌株送北京华大基因公司测序，序列比对正确的菌株摇菌，提取质粒，转化农杆菌EHA105。利用农杆菌瞬时转化法，把含有融合表达载体的农杆菌注射到2周大的本氏烟草叶片的组织细胞间隙，共培养3～5 d，然后用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片表皮，同时以不含目的基因的pBI121-GFP空载体为对照。

1.6　白番红花CrCBF1转录因子激活活性分析

构建酵母表达载体pGBKT7-CrCBF1，用BamH I 和EcoR I 限制性内切酶对pGBKT7 载体进行双酶切，对产物进行纯化回收。设计引物CrpGBKT7-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1质粒为模板进行PCR扩增，产物纯化回收。利用pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒，把目的基因片段连入pGBKT7 线性载体，构建pGBKT7-CrCBF1重组载体。转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落，PCR检测为阳性的菌株送北京华大基因公司测序。序列比对正确的菌株摇菌，提取质粒，转化酵母Y2H，酵母的转化采用PEG/LiAc法[15]，转化后的酵母经SD/-Trp固体筛选培养基30 ℃倒置培养2～3 d，挑取单菌落接种于SD/-Trp单缺液体培养基，30 ℃震荡培养至OD600为2.0。菌液分别点于SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-His/X-α-Gal 固体筛选培养基上。30 ℃倒置培养2～3 d，观察菌落的生长及显色情况，并以转入空载pGBKT7的酵母作为阴性对照，同时以含有pGBKT7-EsDREB2B载体的酵母菌株作为阳性对照[16]。

1.7　白番红花CrCBF1基因酵母功能验证分析

构建酵母表达载体pYES2-CrCBF1，利用Kpn1单酶切质粒pYES2，设计特异性引物CrpYES2-F/R(表1)，以pMD19-CrCBF1质粒为模板进行PCR扩增，产物纯化回收，利用pEASY®Uni Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒，目的基因片段连入pYES2线性载体，构建酵母表达载体pYES2-CrCBF1，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落，PCR检测为阳性的菌株送北京华大基因公司测序，序列比对正确的菌株摇菌，提取质粒，转化酿酒酵母INVSc1，酵母的转化采用PEG/LiAc法[15]。酵母涂布于SC-U尿嘧啶缺陷型固体筛选培养基(终浓度2%葡萄糖为碳源)中30 ℃培养2～3 d。挑取单克隆酵母菌落于SC-U(终浓度2%葡萄糖为碳源)液体培养基中培养至OD600为0.8，之后菌体重悬于SC-U(终浓度2%半乳糖为碳源)诱导培养基中，调整OD600为0.4，30 ℃诱导培养36 h。收集菌体重悬于SC-U(终浓度2%葡萄糖为碳源)液体培养基中，调整OD600为2.0。-20 ℃冷胁迫72 h[17-18]。胁迫后的菌液在SC-U(终浓度2%葡萄糖为碳源)固体培养基上进行梯度稀释验证，观察菌株的存活状况，并以转入空载pYES2的酵母作为对照。

2　结果与分析

2.1　白番红花CrCBF1基因的克隆及生物信息学分析

以白番红花cDNA为模板，以设计的全长引物进行PCR扩增，把纯化的PCR产物连接到pMD19-T载体后送样测序，得到CrCBF1完整的cDNA序列。结果显示白番红花CrCBF1基因开放阅读框长度为642 bp,共编码213个氨基酸。

ProtParam工具计算显示，CrCBF1蛋白的分子量为23.8 kD，理论等电点为4.99。利用NCBI中BLASTP同源性检索，发现该序列和马蔺(Irislacteavar.lactea)IlCBF1(AAZ57434.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBF1(NM118681)、萝卜(Raphanussativus)RsCBF1(ACX48435.1)的相似性分别达到97%、98%和77%。利用ExPASy的SOPMA工具对CrCBF1氨基酸序列的二级结构进行分析，显示CrCBF1蛋白由32.39%的α-螺旋(alpha helix)，7.98%的β-折叠(beta turn)，15.02%的延伸主链(extended strand)和44.60%的无规卷曲(random coil)组成，可以看出，无规卷曲是CrCBF1蛋白的主要组成部分，α-螺旋、β-折叠以及延伸主链则散布在蛋白序列中。利用NCBI蛋白保守结构域分析工具CDD分析显示，CrCBF1蛋白在第46～106个氨基酸之间是AP2/ERF保守序列(图1)。利用Phyre 2.0工具分析CrCBF1蛋白的AP2结构域，显示这个结构域由3条反向的β折叠、1条α螺旋和一段无规卷曲组成，其对应的序列在图1中标出。利用MEGA5.0软件，通过邻近法构建CrCBF1蛋白与其他物种的同源关系进化树(图2)，系统进化树分析显示：白番红花CrCBF1蛋白除了与单子叶植物马蔺蛋白进化树关系相近，与其他单子叶植物大麦、水稻及罗汉竹的CBF1蛋白进化树关系较远，而与双子叶植物亲缘关系较近，发现与十字花科物种的拟南芥、小白菜和萝卜CBF1蛋白进化树关系相近。

DQ074478.苹果；ABV27087.拟南芥；AAL84170.大麦；.β-折叠；.α-螺旋图1　白番红花CrCBF1与其他植物CBF1蛋白的多重序列比对DQ074478.Malus domestica；ABV27087.Arabidopsis thaliana；AAL84170.Hordeum vulgare；.β-sheet；.α-helixFig.1　Multiple alignment of CBF1 proteins in Crocus alatavicus and other plants

2.2　白番红花CrCBF1蛋白亚细胞定位分析

含有融合表达载体pBI121-CrCBF1-GFP的农杆菌注射到2周大的本氏烟草幼苗中，使得农杆菌进入到烟草的组织细胞间隙，利用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片表皮，显示目的蛋白携带的GFP发出的绿色荧光定位在细胞核(图3)，在空载的对照中，GFP发射的荧光定位于细胞核和细胞膜(图3)。结果表明白番红花CrCBF1蛋白定位于细胞核，此结果和拟南芥AtCBF1蛋白定位结果一致[5]。

2.3　白番红花CrCBF1转录因子激活活性分析

观察在涂有X-α-Gal的筛选培养基上阳性菌株的生长及显色情况来检测基因的自激活活性,结果如图4所示,结果表明：阴性对照，即转pGBKT7空载Y2H酵母，在单缺培养基上可以生长，在双缺培养基及涂有X-α-Gal的双缺培养基上不能生长不显色，阳性对照(实验室保存)和重组酵母均可以在双缺培养基上生长，并在涂有X-α-Gal双缺培养基上生长显蓝色，表明CrCBF1蛋白具有转录自激活活性。

图4　CrCBF1自激活活性分析Fig.4　Transactivation activity assay of CrCBF1 in yeast cells

A～C. CrCBF1在烟草中的定位情况；D～F. 空载pBI121-GFP在烟草中的定位情况。A、D. 荧光通道；B、E. 明场；C、F. 叠加图；图3　白番红花CrCBF1蛋白在烟草中的亚细胞定位A-C.Nicotiana tabacum L. cells were transformed with CrCBF1； D-F.N. tabacum L. cells were transformed with pBI121-GFP. A， D. Fluorescence；B， E. Bright field；C， F. MergeFig.3　Subcellular localization of CrCBF1 protein in N. tabacum L.

10-1、10-2、10-3、10-4、10-5分别代表菌液稀释10、100、1 000、10 000、100 000倍A. 无胁迫(对照)；B. -20 ℃冷胁迫72 h图5　重组酵母和对照酵母在冷胁迫条件下的生长状况10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 represent 10, 100, 1 000, 10 000, 100 000 times dilutions of yeast cellsA. Non-stress (control)；B. Freezing stress (-20 ℃) for 72 hoursFig.5　Growth of S. cerevisiae yeast cells transformed with the empty vector pYES2 and with the pYES2-CrCBF1 under cold stress conditions

2.4　白番红花CrCBF1基因酵母功能验证分析

为研究CrCBF1基因的功能，挑取重组酵母和对照酵母单克隆菌落，在以葡萄糖为碳源的SC-U筛选培养基中培养至OD600为0.8，然后在以β-半乳糖为碳源的SC-U诱导培养基中(调整OD600为0.4)诱导培养36 h，进行冷胁迫处理。由图5可见，在非胁迫条件下重组酵母和对照酵母的生长状况基本一致(转基因酵母相对于对照酵母长势稍差一些)，而在20 ℃黑暗冷处理72 h后，重组酵母的生长状况明显优于对照酵母的生长状况，表明在酵母中过表达CrCBF1基因可以提高酵母的抗寒能力。

3　讨　论

AP2/ERF转录因子是植物特有的大家族转录因子，包括4个主要的亚家族：AP2、RAV、ERF和DREB亚家族[19]，CBFs蛋白又称为DREB1蛋白[20]，属AP2/EREBP家族转录因子，能识别CRT/DRE冷及脱水响应元件，在拟南芥中很多冷及脱水响应相关基因的启动子中均含CRT/DRE元件[21]，CRT/DRE元件含有保守的5 bp核心基序CCGAC[22]。

本实验克隆得到了白番红花CrCBF1基因的cDNA序列，序列分析表明，CrCBF1蛋白有一个由60个氨基酸组成的AP2结构域，且在AP2结构域的上下游分别含有被认为是CBF转录因子特征序列的两段短肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR[23]，分别位于AP2基序的上游和下游，推测可能为CBF蛋白的核定位信号区及转录激活区[5, 24]，这2段保守序列也表明CrCBF1是典型的CBF转录因子。

亚细胞定位实验显示，CrCBF1转录因子主要作用于细胞核，这一结论与拟南芥AtCBF1转录因子[5]、短柄草BdCBF1转录因子[14]定位结果一致，但也有些转录因子定位于细胞核和细胞膜，如OsDREB2E转录因子[25]，有研究表明一些转录因子可分布在细胞质中作为结构蛋白参与细胞质的重要反应[26]。转录因子主要在转录水平发挥作用，所以一般定位于细胞核，一些转录因子含有一个或者多个NLS区，可引导其进入细胞核，也有些转录因子不含NLS，通过和其它转录因子形成复合物以进入细胞核，转录因子也可以在分子伴侣及其它跨膜蛋白的作用下通过对自身构象的改变以作用于不同的细胞器。

在酵母功能验证实验中，对转CrCBF1基因酵母和转空载酵母进行干、盐、冷和热胁迫，结果显示，转基因酵母在冷胁迫下，其耐冷性强于转空载酵母，而在干(30% PEG6000 48 h)、盐(5 mol·L-1NaCl 48 h)及热(45 ℃ 48 h)的胁迫下，其生长状况和转空载酵母相比并没有优势(实验结果未发表)，表明CrCBF1基因在酵母中主要参与调控冷相关基因的表达，不响应干、盐及热等胁迫，这一结论与在拟南芥中AtCBF1基因的表达只受低温胁迫调控，而不受干、盐胁迫调控结果一致[27]。本实验采用的酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株，冷胁迫处理方法为-20 ℃处理72 h，Rodriguezvargas报道，在酿酒酵母中过表达ERG10基因，在-20 ℃处理5 d后，酿酒酵母出现生存率表型差异[18]，李海燕等报道，在酿酒酵母中过表达齿肋赤藓ScDREB基因，-20 ℃处理36 h后，酿酒酵母出现表型差异[28]，这些实验不同的冷处理时间可能和胁迫前菌液的浓度以及胁迫后点样的量相关，也可能是由于过表达不同的基因对酵母的作用机制不同导致表型差异所需的时间不同。

本实验克隆得到了白番红花CrCBF1基因，初步探讨了该基因的一些特性，酵母功能验证表明CrCBF1基因可以提高酵母的耐冷性能，为下一步拟南芥体系功能验证及基因开发利用奠定了基础。

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