基于SSR标记的彩色马铃薯亲缘关系分析及指纹图谱构建

王若秋，赵　朋，王冬冬，王耀红，陈　勤

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室 西北农林科技大学 农学院，陕西杨陵 712100)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大粮食作物之一，也是菜、饲和工业原料兼用作物。由于马铃薯营养丰富，粮菜兼用，含有丰富的维生素及钙、钾等微量元素，且易于消化吸收，老少皆宜，功能齐全，颇受人们称赞。有的称誉它为“第二面包”，有的赞扬它是“植物之王”[1]。在欧美国家特别是北美，马铃薯早就成为第二主食。2015年1月中国农业部发布消息称将推动马铃薯主粮化战略[2]。马铃薯相比三大主粮的优势在于，种植周期短、产量高[3]。与普通马铃薯相比，彩色马铃薯含有较多的花青素、多酚、类黄酮等抗氧化活性物质，具有较高的营养价值和保健作用[4]。彩色马铃薯含有多种花青素，使其抗氧化活性达到普通马铃薯的2～3倍[5]。因此，彩色马铃薯的培育及保健作用研究成为当前科研热点。

彩色马铃薯培育中，利用亲缘关系较远的彩色马铃薯彼此杂交，发挥杂种优势，有利于培育色素含量更高的新品种。然而，中国马铃薯品种鉴定一般基于传统的形态学特征，如块茎性状、叶型、花色等[6]，这些性状容易受环境条件影响,并且对植物及块茎成熟度等都有一定的要求[7]。如何快速准确鉴别彩色马铃薯品种，选配优良杂交亲本组合培育新品种，已成为当前马铃薯育种工作中急需解决的问题。SSR分子标记克服了形态标记的不足，扩增结果稳定、检测手段简便易行，与RFLP等其它分子标记相比，具有基因组间分布广、共显性、多态性高、重复性好、扩增结果稳定及操作简单等优点，被广泛应用于植物亲缘关系分析、指纹图谱构建等方面。王绍鹏等[8]利用4对引物对黑龙江省7个主栽品种进行SSR标记，通过相似度分析区分出6个马铃薯品种。段艳凤等[9]利用SSR标记构建了中国在2000～2007年之间审定的88个马铃薯品种的指纹图谱并进行了遗传多样性分析，聚类分析结果与供试材料系谱来源具有较好一致性，同一栽培区域育成的品种在不同程度上聚在一类。张自强等[10]从90对SSR引物中筛选出10对多态性好、重复性强的引物将36个马铃薯品种划分成7类，从DNA分子水平揭示出各供试品种间的亲缘关系。目前，国内彩色马铃薯品种并不丰富，因此关于彩色马铃薯种质资源遗传多样性的报道仍比较少见。

本研究旨在利用SSR分子标记技术，对33份彩色马铃薯种质材料进行遗传多样性分析，构建分子标记指纹图谱，为彩色马铃薯新品种的选育提供科学指导并为彩色马铃薯种质资源的快速鉴定提供技术依据。

1　材料和方法

1.1　试验材料

试验选用33份国外引进和西北农林科技大学马铃薯课题研究组自主培育的彩色马铃薯品种(系)进行遗传多样性分析，各品种(系)薯皮和薯肉颜色见图1和表1。

图1　部分彩色马铃薯原原种块茎Fig.1　Tuber traits of some pigmented potato varieties

编号Number材料Material薯皮颜色Potatoskincolor薯肉颜色Fleshcolor编号Number材料Material薯皮颜色Potatoskincolor薯肉颜色Fleshcolor1CQP46白White白White18CPW19红Red红Red2CQP67紫Purple浅紫Lightpurple19CPW199紫Purple紫Purple3CQP69红Red红Red20CPW2紫Purple花紫Whiteandpurple4CQP70紫Purple紫Purple21CPW29红Red红Red5CQP71浅红Lightred黄Yellow22CPW35浅紫Lightpurple淡红Aarnation6CQP72紫Purple紫Purple23CPW36浅紫Lightpurple淡红Aarnation7CQP75红Red白White24CPW37红紫Reddishviolet红紫Reddishviolet8CQP77紫Purple紫Purple25CPW38浅紫Lightpurple淡红Aarnation9CQP82黄Yellow黄Yellow26CPW45红Red红Red10CQP85红紫Reddishviolet红Red27CPW47紫Purple紫Purple11CPW10紫Purple紫Purple28CPW48紫Purple紫Purple12CPW100紫Purple花紫Whiteandpurple29CPW55紫Purple紫Purple13CPW11紫Purple紫Purple30CPW6红紫Reddishviolet红紫Reddishviolet14CPW12红Red红Red31CPW8紫Purple紫Purple15CPW14红Red红Red32CPW84浅紫Lightpurple浅紫Lightpurple16CPW15红Red红Red33CPW99紫Purple紫Purple17CPW16红Red红Red

1.2　马铃薯DNA提取

取苗期马铃薯植株幼嫩、健壮且新鲜的叶片，置于保鲜袋中在液氮中速冻，于-80℃低温冰箱保存，用于基因组DNA的提取。采用CTAB小量法[11]提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，微量分光光度计NanoDrop 2000测定提取DNA浓度，然后将样品稀释为100 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3　SSR 标记分析

本试验参考其他相关研究文献[12]，选择了马铃薯染色体组上的22个SSR标记，引物序列等相关信息见表2。引物均由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

扩增反应体系为15 μL：ddH2O为4.50 μL，2×Es Taq MasterMix(Dye)为7.50 μL，10 μmol/L正向引物为0.75 μL，10 μmol/L反向引物为0.75 μL，DNA模板为1.50 μL。

扩增反应程序：94 ℃模板预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，重复30个循环；72 ℃终延伸2 min，4 ℃保存。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结束后用硝酸银染色观察结果[13]。

1.4　数据统计及聚类分析

根据 SSR位点上银染带型的有无，转换为二进制数据，有条带的赋值为“1”，无条带的赋值为“0”。利用NTSYS-pc 2.10软件分析试验材料的遗传多样性。其中，以Qualitiative data模块计算试验材料间的遗传相似系数，SAHN模块采用非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析，Tree plot模块用于绘制树状聚类图。

多态信息量(Polymorphism information content，PIC)的计算依照公式[14]PIC= 1-∑Pi2，表征SSR标记多态性信息含量(遗传多样性指数)。对某一特定SSR标记引物扩增出的多态性片段，Pi为第 i 个等位基因在所有品种中出现的频率。

2　结果与分析

2.1　DNA提取结果

将33份彩色马铃薯品种(系)提取的DNA各取5 μL，分别与1 μL Loading buffer混匀，用 1%琼脂糖凝胶，120 V电压，电泳30 min，用紫外凝胶成像仪观察电泳结果。从电泳结果(图2)可以看出，本试验所提取的马铃薯DNA，电泳条带清晰无拖尾，只有1条带，片段大亮度高，说明提取的基因组DNA没有降解，浓度较高。经微量分光光度计测定，DNA浓度多在800～1 000 ng/μL之间，在质量与数量上均满足后续试验要求。

表2　SSR标记引物名称及序列

M. DL500图2　马铃薯基因组DNA琼脂糖电泳Fig.2　Agarose electrophoresis of potato genome DNA

2.2　SSR标记多态性分析

试验采用22对SSR标记引物(表2)，对33份彩色马铃薯材料进行PCR扩增，结果如表3所示。

由表3可知，22对引物组合共检测到95个等位位点，其中82个为多态性位点，多态性比率达86.31%，并且DNA片段的长度多在50～400 bp之间，表明供试材料的SSR多态性丰富。每对引物扩增出的等位位点数为1～12个，平均每对引物扩增出的等位位点数为4.31个。其中，引物STI005多态性条带最多，为12条；引物STM1053多态性条带最少，仅有1条。多态信息量(PIC)为0.168 7(STM1053)～0.991 9(STI033)，平均为0.841 1。图3为引物STM2022在部分彩色马铃薯材料中的扩增结果。

2.3　彩色马铃薯亲缘关系聚类分析

由表4可知，33份彩色马铃薯材料之间遗传相似系数在0.53～0.91之间。其中，CPW15与CPW16遗传相似系数最大，为0.91，CQP75与CPW100遗传相似系数最小，为0.53。

按照UPGMA方法进行聚类分析[15],得到33份供试材料的遗传关系聚类图(图4)。通过共表型相关(cophenetic correlation)分析得出相关性系数(r)为0.72，说明聚类结果较好。在相似系数0.71处，33份供试材料分为4个主要聚类群。其中，类群Ⅰ包括7个材料，4个材料为红紫色薯皮红紫色薯肉，其余3个都是浅紫色或淡红色马铃薯品种(系)；类群Ⅱ最大，包括17个材料，除CQP71为浅红色薯皮黄色薯肉之外，其余材料均为紫色或红色马铃薯品种(系)；类群Ⅲ包括7个材料，4个材料为均紫色或浅紫色马铃薯品种(系)，CQP46和CQP75为白色薯肉，CQP82薯皮薯肉均为黄色；类群Ⅳ只有CPW2和CPW100，均是花紫色马铃薯(花紫色是指薯肉白紫相间)。

表3　SSR标记扩增结果

2.4　指纹图谱分析

依据22对引物扩增条带的统计分析，综合考虑条带读取难易程度[16]、重复性高低、多态性信息含量等[17]，筛选出STM0031、STM0030、STI014、STM1029、STI001共5对引物用于构建33份彩色马铃薯材料的分子标记指纹图谱。STM0031扩增出的条带大小分别是210、195、175和120 bp；STM0030扩增出的条带大小分别是160、140和133 bp；STI014扩增出的条带大小分别是140、132、120 和113 bp；STM1029扩增出的条带大小分别是170和160 bp；STI001扩增出的条带大小分别是240、230、210、198、194和189 bp。这5对引物在所有供试材料中可检测到19个等位位点，多态性等位位点达18个，平均每对引物可以检测出3.6个等位位点。利用这5对引物，可以完全区分33份供试彩色马铃薯材料(表5)。

相似系数 Similarity coefficient图4　彩色马铃薯遗传关系聚类图Fig.4　Genetic clustering tree map of pigmented potato

M.DL500；1～23分别为马铃薯品种CQP46、CQP67、CQP69、CQP70、CQP71、CQP72、CQP75、CQP77、CQP82、CQP85、CPW10、CPW100、CPW11、CPW12、CPW14、CPW15、CPW16、CPW19、CPW199、CPW2、CPW29、CPW35、CPW36 图3　引物STM2022扩增结果M. DL500; 1 to 23 are CQP46, CQP67, CQP69, CQP70, CQP71, CQP72, CQP75, CQP77, CQP82, CQP85, CPW10, CPW100, CPW11, CPW12, CPW14, CPW15, CPW16, CPW19, CPW199, CPW2, CPW29 , CPW35, CPW36Fig.3　Amplification results of primer STM2022

表5　彩色马铃薯基因型指纹图谱

品种(系)Variety(line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

注：0表示该位点处无条带，1表示该位点处有条带

Note: 0 means there is no band at this locus, while 1 means there is a band at this locus

3　讨　论

目前，马铃薯育种仍以品种间杂交为主，亲本的选配显得尤为重要[18]，既需要亲本携带目标性状或目的基因，又需要扩大亲本间的遗传差异。不同种质资源亲缘关系分析和指纹图谱的构建，对于杂交育种中优良亲本组合的选配及品种的快速鉴定具有重要的意义。而分子标记技术可以不受组织发育阶段和环境条件的影响[19]，从DNA水平上区分不同品种间的遗传差异，稳定可靠。为更好研究彩色马铃薯遗传多样性、为彩色马铃薯资源鉴定和利用提供依据[20]，本次研究中选用了33个表型有显著差异的马铃薯,利用22对引物进行亲缘关系的分析。结果表明33个马铃薯品种的遗传关系差异较大，可分为4个类群。其中，类群Ⅰ的7个材料均为(红)紫色薯皮(红)紫色薯肉；类群Ⅱ的17个材料，除CQP71为浅红色薯皮黄色薯肉之外，其余16个材料均为紫色或红色马铃薯品种(系)；类群Ⅳ只有2个材料CPW2和CPW100，均是花紫色马铃薯。上述结果说明3个类群内彩色马铃薯间的亲缘关系比较接近，遗传背景差异小，遗传多样性水平低，可能与杂交育种的亲本单一有关。因此在选择杂交亲本时，在满足育种目标的同时应充分考虑其遗传差异。类群Ⅲ包括7个材料，其中4个材料为(浅)紫色马铃薯品种(系)，2个材料为白色薯肉，CQP82薯皮薯肉均为黄色。从亲缘关系来看，它们的遗传基础较为相似，可能由于控制色素合成的基因差异较大，所以薯皮薯肉颜色并不一致。

本研究利用22对引物将33个供试材料在相似系数0.71处分为4个类群。石景等[15]用56对SSR引物分析了55份彩色马铃薯供试材料，在相似系数0.63处可将全部材料分为三大类。段艳凤等[9]用10对SSR引物分析了88个马铃薯审定品种的亲缘关系并构建了指纹图谱，在相似系数0.652处，81.8%的材料仍聚类在一组，说明供试材料遗传基础非常狭窄。李先平等[21]用41个SSR标记检测了30份彩色马铃薯材料的亲缘关系，供试材料分为两大类群。上述研究结果与本研究结果较为一致，马铃薯品种(系)遗传类群较少，表明中国目前的马铃薯品种及种质资源遗传背景相近，遗传基础组成较为狭窄。

本研究所用彩色马铃薯材料表现出相对较大的遗传基础差异，这可能得益于部分国外新引进种质资源，提高了彩色马铃薯的遗传多样性。虽然供试材料在4个主要聚类群之间表现出较大遗传差异，但是每个类群之内遗传基础比较狭窄。因此，在彩色马铃薯新品种选育中，应选择遗传差异丰富的种质资源进行杂交，以拓宽遗传基础，提高彩色马铃薯品种营养性的同时增强其对环境胁迫的抵御能力[22-23]。通过对这33份彩色马铃薯材料的遗传多样性分析及指纹图谱构建，将有助于提高彩色马铃薯新品种选育效率。

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