环境因素对黑色中性笔墨迹中PEG低聚物降解的影响研究

孙其然，张清华，王雅晨，杨旭

（司法鉴定科学研究院上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063）

黑色中性笔在国内的使用范围较广，因其书写流畅、墨迹不易洇散和褪色，而受到人们的欢迎。尤其是以炭黑为着色剂的黑色中性笔，色牢度好，适合在各种重要文件上书写。在文检鉴定实践中，黑色中性笔墨迹也是常见的检材之一，有关黑色中性笔（签字笔）字迹的形成时间鉴定需求不断增长。

黑色中性笔墨水中的主要成分由着色剂、溶剂和树脂等组成[1]。除了染料外，相当一部分的黑色中性笔墨水中的着色剂用的是炭黑颜料。借助一些稳定剂、表面活性剂的作用，这些颜料颗粒均匀地分散在凝胶状的墨水中，无法像染料一样用薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）法等进行检测;而气相色谱-质谱（GC/MS）法只适用于检测新鲜墨迹中的挥发性溶剂[2]。因此，对于以炭黑为着色剂的黑色中性笔墨迹，除了一些物理方法如显微形态检验、测量笔道电阻[3]外，可用的仪器分析方法较为有限。

聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）的通用分子式为OH（CH2CH2O）nH，结构单元C2H4O是一组分子量相差44Da的化合物。PEG低聚物（指聚合度较小的PEG，一般n在20以内）是中性笔墨水中的常见成分，主要作为润湿剂。应用液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）法，可检测中性笔墨迹中的PEG低聚物。前期研究发现，PEG会发生氧化降解[4-5]，黑色中性笔墨迹中PEG低聚物的降解主要表现为低分子量PEG丰度增加，高分子量PEG丰度降低[6]。在书写时间研究中，环境因素的影响不容忽视，例如光照会促使圆珠笔墨迹中碱性染料降解，而高温会加速圆珠笔、中性笔墨迹中有机溶剂挥发[1，7]。因此，环境是研究文件材料老化必须考量的因素之一。本研究通过设置不同的文件存放环境，应用LC-HRMS分析技术考察光照、温度和湿度对于中性笔墨迹中PEG低聚物降解变化的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

PEG 400标准品（USP reference standard，1 g）（国药集团化学试剂有限公司）；HPLC级乙腈；乙酸铵（≥99.0%）（美国Sigma-Aldrich公司）；HPLC级二甲亚砜（DMSO）（国药集团化学试剂有限公司）。去离子水由Milli-Q Integral 3纯水仪制得。

10 mM乙酸铵溶液配制：称取0.385 g乙酸铵，用去离子水溶解，定容至500 mL，摇匀待用。

1.2 黑色中性笔样品

选择6支炭黑类黑色中性笔，用直尺在同一张A4纸上划线，平行制作3份墨迹样品。样品信息见表1。

表1 黑色中性笔样品信息

1.3 仪器

KQ-100超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Integral 3纯水仪（德国默克公司）；MiniSpin离心机（德国Eppendorf公司）。SUNTEST CPS+文件老化仪（美国Atlas材料测试技术公司），氙灯波长范围300～800 nm。PH050A型干燥箱、LHS-80HC-II恒温恒湿箱（上海一恒科技有限公司）。LC-HRMS系统由美国Thermo Fisher Scientific公司的Ultimate 3000液相色谱仪和Q Exactive台式Orbitrap质谱仪组成。数据分析使用Thermo Xcalibur 3.0软件。

1.4 样品提取

用Harris Micro-punch 0.5 mm直径的打孔器取样，每一墨迹取2份样，每份10个点。取下的墨迹样品放置在1.5 mL的EP管中，向样品中加80 μL DMSO，超声20 min后，将样品放入离心机中，以13，000 rpm的转速离心20 min。取50 μL上清液转移至样品瓶中待分析，进样体积5 μL。

1.5 老化实验

1.5.1 光照环境（L）

取1张写有6支黑色中性笔墨迹的样品纸张，放入文件老化仪中，以40℃、250 W/m2的辐照强度进行光照老化，老化5 d，按照1.4项下每天取样分析。

1.5.2 高湿度环境（H）

一是水资源安全，包括水量充裕和结构均衡。水量充裕，既有总量的充裕，也有人均量的充裕。结构均衡包括地区均衡与人群均衡。水资源分布的不均衡，不仅增加了供水时间和成本，还有可能引发取水纠纷和洪涝灾害，是导致水资源安全问题的原因之一；人群不均衡表现在人群阶层，特别是收入阶层的差异，导致获取水资源经济能力（支付能力）上的差异，也是影响水资源安全的重要因素之一。

取1张写有6支黑色中性笔墨迹的样品纸张，放入恒温恒湿箱中，设置温度为25℃，湿度为80%RH，放置3个月，分别在制样当天、第10天、第19天、第27天、第34天、第48天、第69天和第85天，按照1.4项下取样分析。

1.5.3 高温环境（T）

取1张写有6支黑色中性笔墨迹的样品纸张，放入温度为40℃的干燥箱中，放置3个月，分别在制样当天、第10天、第19天、第27天、第34天、第48天、第69天和第85天，按照1.4项下取样分析。

1.6 LC-HRMS条件

液相色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱（150×2.1mm，5μm），柱温40℃，梯度洗脱程序（表2）。整个液相分离过程为32min，第0～2min和第30～32min里，用切换阀将洗脱液切换到废液池。

表2 液相色谱梯度洗脱程序

质谱采用ESI离子源，正离子模式，电压3.5kV。壳气、辅助加热气和碰撞气均使用高纯氮。辅助加热温度为300℃，毛细管喷针的温度为350℃。全扫描模式，m/z 100～1 500。分辨率设为70 000（半峰宽）。在每批次进样分析前，用Thermo提供的校正液对质谱的质量轴进行校正，以使质量数偏差小于5 ppm。

1.7 定量参数

峰高比R用于表征PEG低聚物之间的相对含量：R=Hb/Hl，其中Hb为基峰的峰高值，Hl为检出的分子量较低的PEG的峰高值。6支黑色中性笔墨水样品所含PEG低聚物有三种分布，分别为：m/z 432±44n，m/z 564±44n，m/z 712±44 n（图1）。据此，1号、2号的定量参数为R432/300，3～5号的定量参数为R564/344，6号的定量参数为R712/492。

检出标准为：抽离子（XIC）色谱图上，信噪比大于3，且信号强度达到105。

2 结果与讨论

在不同环境下，6支黑色中性笔墨迹中PEG低聚物的R值变化（图2～7）。结果表明，尽管所含PEG分子量不同，但它们的变化趋势相同。

图1 黑色中性笔墨水中3种PEG低聚物分布

图2 不同环境下，1号样品中R432/300随时间的变化

图3 不同环境下，2号样品中R432/300随时间的变化

图4 不同环境下，3号样品中R564/344随时间的变化

图5 不同环境下，4号样品中R564/344随时间的变化

图6 不同环境下，5号样品中R564/344随时间的变化

图7 不同环境下，6号样品中R712/492随时间的变化

PEG的降解是自由基氧化反应引起的，PEG层叠的链状结构中间存在较高的应力，降低了置换氢原子的活化能，因而易受自由基攻击[8]。在三种环境中，光照环境下R值下降最快。虽然光照老化的温度设置为40℃，与高温老化的温度相同，但是在前者环境下，R值下降速度比后者明显要快。这一方面是由于光照提供了能量，另一方面是因为老化箱中有持续不断的用于控温的空气气流。Han等对PEG发生自由基氧化的条件做过较系统的研究，发现在这一反应过程中，空气（氧）比热能更重要：在同样的80℃，空气中的PEG发生了明显的降解，而真空条件下的PEG几乎没有变化[8]。老化箱中的光照和气流提供了PEG发生自由基氧化反应所需的能量和氧气，因而PEG的降解速度较快。

在同样避光的高温和高湿度环境下，6支黑色中性笔样品的R值变化速度相近。总体而言，在高温环境下PEG的降解速度比高湿度环境下的快，表现为R值更小，这是由于高温提供了氧化反应的能量。实验中也发现，存放2个月后，在3～5号样品中，高湿度环境下R值≤高温环境下R值。事实上，在25℃、80%RH的环境下放置2个月后，样品纸张表面出现霉斑。由此推测，在高湿度环境下，中性笔墨迹中PEG的降解主要是由微生物分解PEG引起的[9]。

3 结论

本研究选用PEG分布有差异的6支黑色中性笔平行制样，分别将样品放置在光照、高温、高湿度环境中，观察各墨迹样品中PEG的降解变化。实验结果显示：有光照和气流的条件下，PEG降解最快，光能和气流提供了PEG发生自由基氧化所需的能量和反应原料。在同样避光的条件下，高温条件下PEG的降解速度比高湿度环境下的快。高湿度环境下PEG的降解主要是微生物引起的生物降解。在实际文件保存环境中，很少出现实验中80%RH的高湿度环境，因此光照和温度将是影响中性笔墨迹中PEG降解的主要因素。

参考文献：

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[2] LI B，XIE P，GUO Y M，et al.GC Analysis of Black Gel Pen ink Stored Under Different Conditions[J].Journal of Forensic Sciences，2014，59（2）：543-9.

[3] 黄建同.测量字迹电阻法判断添加变造字迹的原理探讨[J].中国人民公安大学学报（自然科学版），2010，63：5-8.

[4] 罗善国，陈福泰，谭惠民，等.NMR研究聚乙二醇的热氧降解[J].高分子材料科学与工程，2001，17（4）：128-133.

[5] HAN S，KIM C，KWON D.Thermal/oxidative Degradation and Stabilization of Polyethylene Glycol[J].Polymer，1997，38（2）：313-23.

[6] SUN Q，LUN Y，XIANG P，et al.Analysis of PEG Oligomers in Black Gel Inks：Discrimination and Ink Dating[J].Forensic Science International，2017（277）：1-9.

[7] Weyermann C，Almog J，Bugler J，et al.Minimum Requirements for Application of ink Dating Methods Based on Solvent Analysis in Casework[J].Forensic Science Iinternational，2011，210（1-3）：52-62.

[8] HAN S，KIM C，KWON D.Thermal Degradation of Poly（ethylene glycol）[J].Polymer Degradation and Stability，1995，47（2）：203-208.

[9] KAWAI F，KIMURA T，FUKAYA M，et al.Bacterial Oxidation of Polyethylene Glycol[J].Applied and Environmental Microbiology，1978，35（4）：679-84.