响应面法优化超声提取总核苷工艺

宋娇娇，杨　勇，谭洪弟，李　喆，余美丽

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁 223800）

核苷类物质包括腺苷、腺嘌呤、3-脱氧腺苷、尿嘧啶、鸟苷、鸟嘌呤、胸嘧啶、胞苷、次黄嘌呤等[1]。核苷类物质对人体免疫、代谢以及肝脏、心血管及神经系统等发挥着重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性[2]，如腺苷具有改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等[3]。洋河酒厂以酿造环境中筛选出1株产核苷类物质的菌株为研究基础，通过固态发酵形成固态发酵物。本研究以核苷功能菌固态发酵物为研究对象，优化超声波提取核苷功能菌固态发酵物中总核苷工艺，为核苷类物质的更广泛应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料、试剂及仪器

实验菌种：洋河酒厂技术中心功能微生物实验室保藏。

核苷功能菌固态发酵物：以核苷功能菌为实验菌株，麸皮为培养基进行固态培养形成的发酵产物。

腺苷对照品：美国sigma公司生产。

AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KH-500DB型数控超声清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；UV-240可见紫外分光光度计，日本岛津。

1.2　试验方法

1.2.1　核苷功能菌固态发酵物制备

以麸皮为培养基质，添加一定比例营养液，接种核苷功能菌，30℃培养4～5 d，形成富含核苷类物质的固态发酵产物。

1.2.2　提取液制备

将核苷功能菌固态发酵物进一步粉碎成粉状，称取1 g粉碎后样品置于500 mL三角瓶中，按一定的料液比添加蒸馏水，在一定提取温度、超声频率条件下提取一定时间后，过滤，取滤液备用。

1.2.3　提取液中总核苷提取量测定[4]

（1）最大吸收波长的确定

将核苷对照品于200～400 nm处作全程扫描,其最大吸收波长在259 nm左右，所以选择259 nm为检测波长。

（2）腺苷对照品储备液的配制

精密称取腺苷对照品1.74 mg，用蒸馏水溶解后，转移至100 mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配制成17.4 μg/mL的水溶液作为对照品储备液，避光冷藏。

（3）腺苷标准曲线的绘制

精密吸取腺苷对照品储备液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL于10 mL容量瓶中，分别用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配制成不同浓度的对照品溶液。以去离子水作为空白，用紫外分光光度法在259 nm处分别测定对照品溶液的吸光度(ABS)，以吸光度为横坐标，腺苷对照品溶液浓度(μg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，结果腺苷对照品在5.208～13.913 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为Y=8.6311X-0.0042，r=0.9998（其中X为吸光值，Y为腺苷浓度，μg/mL）。

（4）样品提取量测定

取核苷功能菌固态发酵物提取液，经0.45 μm水系滤膜过滤，适当稀释至标准曲线浓度范围，摇匀。以去离子水作为空白，用岛津UV-240可见-紫外分光光度计在波长259 nm处测定其吸光度，计算出总核苷类物质的含量。

1.2.4　单因素试验

固定料液比100∶1，提取温度50℃，超声频率70 Hz，分别选取提取时间15 min、30 min、45 min、60 min、75 min进行超声提取，平行提取3次，考察提取时间对总核苷提取量的影响。

固定提取时间30 min，超声频率70 Hz，提取温度50 ℃，料液比（ mL/g）分别按照50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1加入蒸馏水进行超声提取，平行提取3次，考察料液比对总核苷提取量的影响。

固定料液比100∶1，提取时间45 min，超声频率70 Hz，分别选取提取温度35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃进行超声提取，平行提取3次，考察提取温度对总核苷提取量的影响。

固定料液比100∶1，提取时间45 min，提取温度50 ℃，分别选取超声频率40 Hz、50 Hz、60 Hz、70 Hz、80 Hz、90 Hz进行超声提取，平行提取3次，考察超声频率对总核苷提取量的影响。

1.2.5　响应面试验设计[5-6]

通过对影响总核苷提取量的单因素分析，选取对总核苷提取量影响显著的单因素提取时间、料液比、提取温度以及超声频率为考察因素，以总核苷提取量为目标值，运用Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，设计4因素3水平响应面分析试验。

1.2.6　数据处理及分析

利用SPSS 21软件进行方差分析，Design Expert 8.0.6.1软件进行响应面分析。

2　结果与分析

2.1　单因素试验结果

2.1.1　提取时间对总核苷提取量的影响（图1）

由图1可知，提取时间15～30 min时，总核苷提取量无显著差异，提取时间45 min时，总核苷提取量显著增加，提取时间超过45 min时，总核苷提取量趋于稳定，无显著变化。说明超声提取时间的延长有助于总核苷提取量的增加，提取时间过短则核苷类物质未充分提取进入溶液，但随着提取时间进一步增加，溶解度达到饱和，总核苷提取量达到最大限度，不再增加[7]。考虑到总核苷提取量、降低能耗等多方面因素，选择最佳提取时间45 min。

图1　提取时间对总核苷提取量的影响

2.1.2　料液比对总核苷提取量的影响（图2）

图2　料液比对总核苷提取量的影响

由图2可知，料液比在100∶1时总核苷提取量达到最大值，再增大提取剂用量，总核苷提取量降低，且继续增大提取剂用量总核苷提取量无显著变化。可能的原因：料液比超过一定范围，会增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降[8]，从而降低核苷类物质的溶出效率。综合考虑选择最佳料液比为100∶1。

2.1.3　提取温度对总核苷提取量的影响（图3）

由图3可知，随着提取温度的升高，总核苷提取量呈先增加后趋于稳定的趋势，可能的原因是温度低于50℃时，随着温度的升高，加强了分子间的相对运动，进一步破坏细胞结构[9]，增强了核苷类物质的溶出；提取温度超过50℃时，温度对核苷类物质的影响不显著。综合考虑提取温度选取50℃。

2.1.4　超声频率对总核苷提取量的影响（图4）

图3　提取温度对总核苷提取量的影响

图4　超声频率对总核苷提取量的影响

由图4可知，在超声频率40～50 Hz范围内，总核苷提取量随着超声频率的增加显著提升，但超声频率超过50 Hz时，总核苷提取量显著下降，再增加超声频率对总核苷提取量无显著影响。说明一定频率的超声处理有利于提升核苷类物质溶出效果，总核苷提取量显著提升，但超声频率过高，可能导致核苷类物质被破坏，总核苷提取量不增反降[10]。因此选择最佳超声频率为50 Hz。

2.2　响应面分析法优化总核苷的超声提取工艺

2.2.1　响应面BOX-Behnken试验设计与结果

依据Design Expert 8.0.6.1软件中的Box-Benhnken试验设计原理，结合超声提取单因素试验结果，选取对总核苷提取量影响显著的提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）以及超声频率（D）为考察因素，用-1、0、+1分别表示低、中、高3水平，以总核苷提取量为响应值（Y），进行4因素3水平响应面优化试验，因素水平编码见表1，响应面试验设计及试验结果见表2。

2.2.2　方差分析和二元回归方程拟合

利用Design Expert 8.0.6.1软件对表2中的数据进行回归分析，对各因素进行回归拟合后，得到总核苷提取量（Y）与提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）以及超声频率（D）之间的四元二次回归方程：

表1　响应面试验设计因素及水平编码

表2　响应面试验设计与结果

Y=3.59+0.070×A-0.21×B+0.30×C-0.058×D+0.02×A×B-0.04×A×C+5.00E-003×A×D+0.033×B×C-0.018×B×D+0.16×C×D-0.042×A2-0.40×B2-0.36×C2-0.090×D2，对该模型进行方差分析和显著性检验，结果见表3。

由表3可知，该回归模型的P＜0.0001，说明所选择的回归方程具有极显著性，试验设计可靠。失拟项P=0.2157＞0.05，说明失拟项差异不显著，表明无失拟因素存在，对模型是有利的，证明该回归方程能够较显著拟合提取时间、料液比、提取温度、超声频率对总核苷提取量的影响，该模型能够代替试验真实点对实验结果进行分析。本试验中模型校正系数（R2Adj）为0.8848，说明总核苷提取量与模型回归有着良好的一致性，该模型能够解释88.48%的响应值变化。因此，该模型是显著且可靠的，可以用来预测超声提取条件对总核苷提取量的影响。

回归方程各项的方差分析结果表明，料液比（B）一次项及其二次项、提取温度（C）一次项及其二次项的P＜0.01，具有极显著性。提取温度（C）和超声频率（D）的交互项P＜0.05，具有显著性。提取时间（A）一次项和二次项、超声频率（D）一次项和二次型、交互项（AB、AC、AD、BC、BD）P＞0.05，对结果影响不显著，剔除不显著项，得到的模型方程为：

总核苷提取量=3.59-0.21×B+0.30×C+0.16×C×D-0.40×B2－0.36×C2。

由F值可知，各因素对总核苷提取量影响大小依次为：C（提取温度）＞B（料液比）＞A（提取时间）＞D（超声频率）。

2.2.3　响应面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2中试验数据进行回归拟合分析，所得响应面及等高线见图5和图6，该图组可直观地反映各个因素及其交互作用对总核苷提取量的影响。其中，等高线的形状可以反映出各因素间交互作用的强弱，如果等高线为鞍型或椭圆形，则表示两者交互作用显著；如果等高线为圆形，则表示两者交互作用不显著[11]。

图5显示了提取时间和超声频率在中心水平下，料液比与提取温度交互作用对总核苷提取量的影响。由图5可知，等高线图为接近圆形，表明提取温度与料液比交互作用不显著。图6显示了提取时间和料液比在中心水平下，超声频率与提取温度交互作用对总核苷提取量的影响。由图6可知，等高线为椭圆形，表明提取温度与超声频率的交互作用是显著的。这与表3中两个交互项的p值0.6051、0.0225相比较，确定交互项中只有提取温度与超声频率的交互作用是显著的。

表3　回归模型方差分析表

图5　料液比与提取温度交互作用影响总核苷提取量的响应面图与等高线图

2.2.4　最佳提取条件的预测与验证

对优化后的回归方程求解，在试验的因素水平范围内预测总核苷提取的最佳条件为：提取时间53.87 min，料液比88.70∶1，提取温度55.96 ℃，超声频率50.63 Hz，在此条件下总核苷提取量为3.69 mg/g。考虑到实际试验操作的可行性，将超声总核苷提取的最佳条件修正为：提取时间54 min，料液比90∶1，提取温度56℃，超声频率50 Hz，在此条件下进行3组验证性试验，测得总核苷提取量为3.79 mg/g,与预测理论值的相对误差在5%以内，说明采用响应面法优化超声提取总核苷工艺的方法可行且快速。

图6　超声频率与提取温度交互作用影响总核苷提取量的响应面图与等高线图

3　结论

本研究考察超声提取条件：提取时间、料液比、提取温度、超声频率4个单因素对总核苷提取量的影响，确定条件优化的范围，然后经响应面法设计并对提取条件进行优化。最优总核苷提取条件为：提取时间53.87 min，料液比88.70∶1，提取温度55.96℃，超声频率50.63 Hz，在此条件下总核苷提取量为3.69 mg/g。最终调整为提取时间54 min，料液比90∶1，提取温度56℃，超声频率50 Hz，在此最佳条件下，总核苷的提取量为3.79 mg/g,与预测理论值的相对误差在5%以内，说明采用响应面法优化超提取总核苷工艺的方法可行且快速。

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