外周血环状RNA在疾病诊断中的意义

陈阳，金龙，韩淑华

(1.东南大学 医学院，江苏 南京　210009；2.江苏大学附属句容医院 呼吸科，江苏 句容　212400)

1　环状RNA的生物学特征

1.1　环状RNA的合成及调控

环状RNA主要有两种方式成环，一是通过内含子配对，缩小剪切位点之间的距离成环；二是通过外显子迁移，剪切成套索结构，通过套索结构拉近剪切位点成环[6]。外显子侧翼序列和RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)可以对成环进行调控。侧翼内含子ALU序列[7]和RNA结合蛋白[8]可促进成环，而RNA剪辑酶ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA 1)则阻止侧翼序列互补，抑制成环[9]。miRNA也可以通过AGO2(Argonaute 2)蛋白对环状RNA沉默来调控环状RNA[10]。

1.2　环状RNA的功能和特点

2　环状RNA的体内运输

环状RNA主要存在于血液外泌体中，由外泌体运输。而将外泌体分离出去后环状RNA含量极少，提示环状RNA主要以外泌体为运输载体[2]。外泌体是一种纳米级别的囊泡，大小在40～150纳米之间，包含有蛋白质、mRNA和miRNA，由双层质膜保护，可以被多种细胞分泌，包括T细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞、内皮细胞，可在多种体液中检测到[14]，包括血浆、尿、唾液、乳汁、支气管灌洗液、脑脊液、羊水和腹腔积液，在细胞培养液[15]中也可检测到，具有调控免疫，介导血管生成，传递遗传信息，调节肿瘤转移微环境的作用。大脑内皮细胞来源的外泌体可以通过血脑屏障[16]，其携带的环状RNA有可能进入外周血液，用于神经系统疾病的诊断。在人类的血清外泌体中发现了超过1 000种环状RNA，外泌体中环状RNA与线性RNA的数量比值是细胞内的6倍以上，考虑环状RNA较线性RNA更易在外泌体中富集[2]。将血清室温培育24 h，外泌体环状RNA水平仍然保持稳定[2]，环状RNA能保持稳定可能与外泌体的保护有重要关系。通过对细胞培养液环状RNA的检测，表明环状RNA可通过外泌体和微泡的形式被分泌到细胞外而清除[15]。环状RNA在外泌体中富集，并被释放到细胞外，这可能是环状RNA细胞外运输及细胞内清除的一种方式。

3　环状RNA组织差异性及相关调控

Li等[21]发现在胃癌组织中Hsa_circ_002059表达较癌旁正常组织明显降低，而术后血浆环状RNA水平较术前升高，被认为可以用作胃癌的诊断标记物。胃癌的发生发展与胃部炎症密切相关，胃癌的发生从急性胃炎、胃黏膜萎缩、肠化生、不典型增生，最终至胃癌，是一个多阶段、渐进性的过程，黏膜炎症是引起胃癌的起始因素。Lu等[22]研究发现Hsa_circ_0006633在胃炎、不典型增生及癌组织中表达水平均显著降低，胃炎组织表达水平明显低于胃癌组织，不典型增生组织与癌组织表达水平无显著差异，表明Hsa_circ_0006633可能参与了胃良性病变的发生，在肿瘤的早期发展中发挥了作用。

4　环状RNA外周血检测的应用

在肿瘤性疾病中，Zhao等[30]发现在胃癌组织中Hsa_circ_0000181呈低表达，且与肿瘤直径、淋巴结转移、远端转移、糖类抗原19-9水平相关，在组织中诊断的ROC曲线下面积为0.756，特异度和敏感度分别为0.852和0.539。而Hsa_circ_0000181在血浆中也呈低表达，其下降水平与肿瘤分化程度及CEA水平存在相关性，在血浆中诊断的ROC曲线下面积为0.582，特异性和敏感性分别为0.20和0.99。组织Hsa_circ_0000181诊断特异性较高，血浆Hsa_circ_0000181诊断敏感性较高。相关文献[31]显示CEA诊断胃癌的敏感性和特异性分别为0.686和0.593，CA19-9为0.605和0.559，血浆Hsa_circ_0000181在胃癌筛查方面具有更高的敏感性。同样，Hsa_circ_0000190[32]在胃癌组织及患者血浆中低表达，其在组织和血浆中联合诊断的敏感性和特异性分别为0.712和0.750，ROC曲线下面积0.775，诊断效果优于CA19-9和CEA[31]。血浆Hsa_circ_0000190水平与CEA水平相关，组织中Hsa_circ_0000190水平与肿瘤直径、淋巴结转移、远端转移、TNM分期、CA19-9水平呈相关性，Hsa_circ_0000190表达水平与临床病理的相关性在血浆与组织中差异较大，可能与血液成分较复杂及肿瘤细胞选择性的释放和吸收RNA有关。

Zhao等[35]通过基因芯片分析糖尿病患者和正常人外周血环状RNA，筛选出5种差异倍数在2.4倍以上的环状RNA，分别为Hsa_circ_0068087、Hsa_circ_0054633、Hsa_circ_0124636、Hsa_circ_0139110、Hsa_circ_0018508，进一步通过前瞻性的队列研究(2型糖尿病组64人，正常对照组60人，糖尿病前状态组63人)，确认Hsa_circ_0054633可以作为糖尿病前状态及糖尿病的诊断标记物。

慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)是一种罕见的，危及生命的肺栓塞并发症。Miao等[36]对5例慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者和5例正常人的血液进行分析，发现351种差异表达的环状RNA(122种上调和229种下调)。数据库比对发现，Hsa_circ_0002062和Hsa_circ_0022342分别可以调节761种和453种miRNA，Hsa_circ_0002062和Hsa_circ_0022342可能是CTEPH发病的关键，对其针对性的调控可能是治疗慢性血栓栓塞性肺动脉高压的一种有效的方法。

烟雾病是一种原因不明的慢性进行性脑血管闭塞性疾病，通过对烟雾病患者血液进行基因芯片分析[37]，发现146种环状RNA差异表达，其中29种表达上调，117种下调。GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析提示，差异表达的环状RNA主要参与血管生成、代谢、免疫反应过程，MAPK信号通路被认为是发病过程的核心调控途径。

表1外周血环状RNA与相关疾病

疾病环状RNA参考文献胃癌Hsa＿circ＿0001649Hsa＿circ＿0000181Hsa＿circ＿002059Li，WH．，etal．(2017)[40]Zhao，Q．，etal．(2017)[30]Li，P．，etal．(2015)[21]胃炎Hsa＿circ＿0000190Hsa＿circ＿0006633Chen，S．，etal．(2017)[32]Lu，R．，etal．(2017)[22]糖尿病Hsa＿circ＿0054633Hsa⁃circRNA11783⁃2Zhao，Z．，etal．(2017)[41]Li，X．，etal．(2017)[38]子痫CircRNA＿101222Zhang，Y．G．，etal．(2016)[42]冠心病Hsa＿circ＿0124644Hsa⁃circRNA11783⁃2Zhao，Z．，etal．(2017)[43]Li，X．，etal．(2017)[38]心力衰竭MICRAVausort，M．，etal．(2016)[39]颈动脉斑块破裂高血压病CircRNA⁃284Hsa＿circ＿0005870Bazan，HA．，etal．(2017)[44]Wu，N．，etal．(2017)[45]

5　小结与展望

目前临床上对一些疾病的诊断往往需要组织病理来确诊，但对于一些深部组织病变，如神经组织、肝脾组织、心肺组织往往难以获取，需要有创检查，对身体可造成伤害。而对于一些进展缓慢的慢性病或恶性疾病，疾病的早期诊断至关重要。所以临床上迫切需要一种无创的、可以早期发现疾病变化的诊断方法。环状RNA参与疾病的调控，在不同时间、不同组织及病变不同阶段有特异性表达,有可能成为一种新型生物诊断标记物。血液中的环状RNA主要存在于外泌体中，并以外泌体为载体运输，受外泌体脂质分子的保护，在血液标本中稳定存在，由于外泌体可以穿透血脑屏障，神经组织病变释放的环状RNA可以在外周血检测，目前已在多种疾病中检测出相关环状RNA。随着人们对不同来源的环状RNA的进一步了解，环状RNA在临床应用前景会更加广泛。

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