囊胚期胚胎二次冷冻复苏移植1例的出生结局和儿童发育情况随访

王雪，甄璟然，孙正怡，郁琦，邓成艳，周远征，王含必

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科生殖中心，北京 100730)

胚胎的冷冻保存是辅助生殖技术(ART)治疗中的重要组成部分，通过冷冻保存可以将患者过多的胚胎保存下来，提高患者的累积妊娠率。胚胎的冷冻保存可以在胚胎发育的任意阶段进行，如有的中心常规冷冻原核期胚胎或卵裂期胚胎，现在随着培养体系的完善，越来越多的IVF中心进行囊胚培养以期提高妊娠率和降低多胎妊娠率，因此研究者更倾向于进行囊胚冷冻保存。冷冻方法可以为程序化慢速冷冻，也可以为玻璃化冷冻。我们中心自2004年起，对第3天移植后的胚胎全部进行囊胚培养，如有囊胚形成则进行玻璃化冷冻保存。然而在临床工作中常存在一些偶发的意外情况，如患者在复苏移植日因突发性原因无法进行胚胎移植，只能将复苏的胚胎丢弃或再次冷冻后择期复苏移植。但是我们无法确定囊胚二次玻璃化冷冻后的安全性如何。目前关于人类胚胎二次冷冻的文献较少，尽管有文献报道了一些病例能够在胚胎二次冷冻复苏移植后获得活产，但这些报道多为第一次冷冻为原核期胚胎或卵裂期胚胎，复苏后培养至囊胚再次冷冻[1-4]。Kumasako等[3]认为二次冷冻不会降低胚胎的种植率，但是关于囊胚冷冻复苏后再次冷冻复苏移植的报道极少。且据我们所知，尚无研究来分析囊胚二次玻璃化冷冻复苏移植后的出生结局。在此病例报道中，我们描述了囊胚二次冷冻复苏移植后新生儿的出生结局，并对此患者的孩子进行长期随访观察，详细记录了此儿童的体格发育情况。

一、临床资料

患者34岁，丈夫35岁，因输卵管因素原发不孕到我院生殖中心就诊，不孕年限6年。根据世界卫生组织标准，男方精液参数正常。患者2005年在本中心进行卵巢刺激后取卵，在取卵周期所采用的促排卵方案按照本中心的常规进行，在上一周期的黄体期开始应用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)，当垂体达到降调节后，用卵泡刺激素(FSH，果纳芬，默克)进行卵巢刺激。当主导卵泡直径达到18～20 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，艾泽，默克)，38 h后进行阴道超声引导的卵泡穿刺来获取卵母细胞。共获得13枚卵母细胞，进行常规授精后，13枚卵母细胞受精，在受精后第3天观察胚胎的卵裂情况，挑选2枚优质胚胎进行移植。移植后剩余的11枚卵裂期胚胎经患者知情同意后全部进行囊胚培养，在受精后第5日或第6日分别观察囊胚形成情况及形态。采用Gardner评分系统对囊胚进行评分，该患者共形成2枚囊胚，囊胚评分分别为4BB和4BC。将所形成的囊胚按照我中心常规方法[5]进行玻璃化冷冻，具体操为：囊胚冷冻前进行人工皱缩，即用激光系统在远离内细胞团的滋养细胞连接薄弱处打孔，让囊腔液流出，使细胞皱缩成团；然后将囊胚放入含有7.5% DMSO和7.5%乙二醇的预平衡液中平衡2 min，之后移入玻璃化冷冻液中平衡30 s，将胚胎转移至冷冻环(cryoloop环)上，直接浸入液氮保存。

患者新鲜周期移植未获得妊娠，取卵3个月后患者进行冷冻囊胚复苏移植。人工周期准备内膜，月经第2～4天行常规B超检查，给予戊酸雌二醇(补佳乐，先灵，德国)口服，口服剂量根据患者以往的内膜情况调整(2～18 mg/d)。B超监测内膜生长情况，当内膜厚度达到8 mm时肌肉注射黄体酮(20 mg×2 d，40 mg×2 d，20～40 mg×1 d)，注射后第6天行囊胚复苏移植。移植前1 d按照我中心常规方法[5]进行囊胚复苏：准备囊胚复苏液，在胚胎培养皿内配制0.33 mol/L、0.2 mol/L蔗糖溶液和基础培养液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)，从液氮中取出带有囊胚的冷冻环，空气中停留5 s后，将胚胎依次浸入上述复苏液中，时间分别为2 min、3 min和5 min。复苏后的2枚囊胚均进行激光辅助孵化，选择在远离细胞团的透明带上部位切割透明带的1/4左右。之后将囊胚移入提前准备好的囊胚培养液(G2，Vitrolife，瑞典)中，放置37℃、6%CO2和5%O2培养箱内培养16 h。移植前观察囊胚的扩张和孵出情况。

该患者在囊胚复苏移植日突发急性阑尾炎不能进行囊胚移植，在患者知情同意的前提下再次按照上述囊胚玻璃化冷冻操作步骤进行胚胎冷冻。患者手术6个月后再次进行冷冻囊胚复苏移植，具体操作步骤同上，囊胚复苏后16 h进行移植，患者成功妊娠，并于孕38周分娩一健康女婴，体长52 cm，体重3 550 g。由于这是本中心第1例囊胚二次冷冻的患者，所以我们对其女进行了长期的随访。孩子的父亲身高为185 cm，母亲身高为167 cm；孩子1岁时，身高83 cm，体重12 kg；3岁时，身高97 cm，体重21 kg，身体健康，无疾病；5岁时，身高117 cm，体重31 kg；7岁时，身高135 cm，体重40 kg；9岁时身高154 cm，体重50 kg；12岁时，身高168 cm，体重62 kg；10岁时，乳房出现发育；12岁时月经初潮。该女孩性格开朗，参加学校管乐队、校篮球队等集体活动，并取得很好的成绩，其智力正常，学习成绩在班级前5名。

二、讨论

在此病例中，患者获得13枚成熟卵母细胞，13枚卵母细胞受精，经过培养后形成2枚囊胚并玻璃化冷冻保存。患者在预定囊胚复苏移植日突发急性阑尾炎，在其知情同意的前提下将复苏后的囊胚再次冷冻保存。此为临床工作中一些难以避免的情况。如果将患者胚胎丢弃非常可惜，而胚胎再次冷冻保存的安全性尚不明确。到目前为止，虽然已经有一些胚胎在二次冷冻后获得活产的病例报道，但都是第一次胚胎冷冻时为原核期或卵裂期胚胎，复苏后培养至囊胚阶段再次冷冻。本研究是首次对囊胚二次玻璃化冷冻后获得的活产进行长期随访的病例报道。

有学者曾经用小鼠胚胎研究反复冷冻复苏对胚胎的影响，他们发现与未冷冻的胚胎相比，冷冻胚胎在孵出时的细胞数略少，且小鼠胚胎能够在成功的反复冷冻复苏3次后仍然具有体外发育能力[6]。在此病例中，我们对比了两次冷冻前后囊胚的形态学变化，第1次冷冻是在第5天，囊胚为4期，质量为4BB，第一次复苏后培养16 h，囊胚完全孵出，成为6期囊胚，质量为6BB；第2次冷冻复苏后，培养16 h囊胚质量为6BB。囊胚形态从外观上看，两次冷冻后没有差异，囊胚细胞存活良好，貌似囊胚阶段胚胎的二次玻璃化冷冻对胚胎的发育无太大影响。分析原因，我们认为可能与以下几个方面有关。首先，囊胚在冷冻之前进行了激光皱缩，将囊胚腔内液全部放出，使囊胚腔塌陷，待囊胚完全皱缩后再进行囊胚的玻璃化冷冻，这样能够减少冷冻过程中冰晶的形成，降低对胚胎的损伤。有研究也证实囊胚的人工皱缩能够有效提高囊胚冷冻后复苏的存活率[7-9]。而且冷冻囊胚复苏后的辅助孵化也非常重要，在胚胎冷冻过程中，人类囊胚的透明带变硬，会限制胚胎的向外孵出，有研究认为囊胚在扩张过程中不断地膨胀皱缩，如果在透明带出口处卡的次数多了，囊胚就会衰亡[10]。而且，冷冻复苏后的囊胚，由于刚刚复苏后囊胚腔还处于皱缩状态，胚胎和透明带之间的间隙远远大于卵裂期胚胎的间隙，因此囊胚的辅助孵化更安全。我们的数据发现，未经过辅助孵化的囊胚，复苏后过夜培养，完全孵出的比例(34%)远低于激光孵化后的囊胚(85%)，更高的孵出比例意味着更高的着床机会。其次，囊胚的冷冻保存不同于卵裂期胚胎，它自身有很多优点。能够发育至囊胚阶段的胚胎经过二次选择，发育能力异常的胚胎已经被淘汰；囊胚的细胞数目多，尤其是滋养细胞层细胞，损伤后修复能力强，少数细胞死亡后对胚胎发育能力影响小；囊胚的细胞更小，呈梭形，表面积/体积比大，对脱水、复水造成的体积变化耐受性更佳[11]。因此我们猜测囊胚二次冷冻后细胞没有损伤的原因可能与此有关。

目前虽然有一些胚胎二次冷冻获得活产的报道，但是对新生儿长期随访的报道非常少见。在此病例中，囊胚经过二次玻璃化冷冻后，仍然能够成功种植，患者在足月分娩一正常体重的新生儿，也提示囊胚二次冷冻似乎并不影响新生儿的出生结局。复习文献，我们发现在2011年的一项小型研究中，作者分析了一次冷冻和二次冷冻后胚胎出生结局的差异[12]。在文中一次冷冻，就是将2PN期或卵裂期的胚胎进行冷冻保存，复苏后移植；二次冷冻指的是冷冻的胚胎复苏后进行体外培养至囊胚阶段，再进行冷冻。结果提示二次冷冻组的双胎率低于一次冷冻组，他们认为是二次冷冻组移植的胚胎数较少造成的。此研究还提示二次冷冻组的出生体重略高于一次冷冻组，尽管没有统计学差异；在二次冷冻组未发生先天异常，在一次冷冻组发生1例先天异常；两组均未发生死胎或新生儿死亡。尽管这些并非囊胚二次冷冻的研究，但从一定程度上反映了胚胎在二次冷冻后并不影响新生儿的出生结局。我们对此新生儿随访至9岁，该儿童体格发育正常，智力发育正常，心理发育正常。与之前冻融胚胎移植(FET)出生儿童的随访结论一致[13-17]。Pelkonen等[13]分析了FET出生孩子的先天异常的发生情况，认为FET出生孩子发生先天异常的比例与新鲜移植相似，之后Pelkonen等[14]对FET后代孩子进行了一项随访3年的研究，发现FET与新鲜移植出生后代的体格发育是相似的。还有研究发现ART后出生后代的神经运动发育方面与自然妊娠后代无显著差异，认为他们的神经发育、社会感情及语言学习并无差异[16-17]。可见胚胎冷冻对新生儿长期发育的影响与新鲜移植胚胎相似。而从我们的病例报道来看，囊胚的二次冷冻也是相对安全的。

我们将囊胚二次玻璃化冷冻后的胚胎进行移植后获得成功妊娠，足月分娩一健康女婴，并进行长达12年的随访，此儿童体格发育正常，智力发育正常，心理发育正常。认为此囊胚二次冷冻后胚胎仍然具有很好的种植潜能和发育潜能。但此病例仅为个例报道，囊胚反复冷冻是否会造成胚胎的损伤仍不明确，移植反复冷冻的胚胎是否安全还需要进一步的研究，因此在临床工作中，我们仍应尽可能避免胚胎的反复冻融。