DNA倍体分析和HPV E6/E7检测诊断宫颈ASCUS的价值

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(1.青岛大学附属威海市立第二医院病理科；2.理疗科；3.儿童保健科 山东 威海 264200)

宫颈癌的发病率是女性生殖系统恶性肿瘤的第一位，而我国宫颈癌的患者数约占世界的1/3以上，其中每年因宫颈癌导致死亡的人数达5万人，且宫颈癌人群日趋年轻化。因此临床上对宫颈癌的早期筛查显得尤为重要。未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)作为伯塞斯达系统(the Bethesda system，TBS)分类法异常结果报告中最常见的细胞学异常，其在病理组织学上具有诊断及分类的多样性。据估计ASCUS 妇女中有5%～10%隐匿有严重的宫颈癌前病变[1-2]，且治疗不及时往往可以发展成为宫颈癌。故有关ASCUS的处理是临床宫颈病变诊治的争论点，且有关其分流处理一直以来是宫颈病变诊治中存在的难点。目前宫颈疾病最常用的筛查方法是宫颈细胞学检查及人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)检测，但令人遗憾的是无论是传统的巴氏涂片还是薄层液基细胞学检查(thinprep cytologic examination，TCT)，单一的宫颈细胞学检查对于宫颈癌前病变及宫颈癌筛查来说，其敏感性均较低[3]。尽管HPV DNA检测可早期发现HPV感染，但HPV感染大多是一过性的，因此其检测的敏感性并不高。本研究选取980例ASCUS患者，进行DNA倍体分析联合HPV E6/E7mRNA检测，探究两者对诊断宫颈ASCUS的价值。

1对象和方法

1.1研究对象

选取2015年1月至2017年3月在青岛大学附属威海市立第二医院妇科门诊及住院部就诊的TCT结果为ASCUS的患者980例。平均年龄为38.9(20～66)岁。排除标准：妊娠，未婚，子宫切除手术史或宫颈手术史，在行化疗或曾经行过化疗及盆腔放疗者，取标本前3天内有阴道冲洗放药或性生活史。本研究中所有受检者均知情同意并签署同意书，本研究获得青岛大学附属威海市立第二医院伦理委员会审核通过。

1.2研究方法

1.2.1标本采集及TCT检测

所有受试检者统一由一位有经验的妇科医师于经期结束3～10天内以窥阴器暴露子宫颈后擦净子宫颈口分泌物，采用TCT专用刷在宫颈口顺时针旋转3圈，停留10s取材，标本放入TCT专用保存管保存行TCT常规检测，剩余标本于-25℃下保存。诊断标准依照癌症协会推荐的TBS分类标准，其结果描述为：高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSILs)；低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSILs)；不排除高度上皮内病变的不典型鳞状细胞(atypical squamouscells-cannot exclude HIS，ASC-H)；ASCUS；未见上皮内病变或恶性病变(No intraepithelial lesions or malignant lesions，NILM)。

1.2.2细胞DNA倍体分析

采用DNA-ICM系统对细胞进行扫描分析，以细胞核DNA指数(DI)为判读标准[(DI=全部被测细胞的DNAIOD值/正常细胞DNA(Go/G1)的IOD平均值)]，其中异常倍体细胞包括DI≥2.5为异倍体细胞、非整倍体细胞或4倍体细胞增加≥10%、出现非整倍体细胞峰。而DI：2.2～2.5为非整倍体细胞；DI：1.2～1.8为出现非整倍体细胞。0.8≤DI<1.2为2倍体细胞即2c细胞，1.8≤DI<2.2为4倍体细胞即4c细胞。本研究主要检测DI>1.25的细胞，包括非整倍体细胞、4c细胞、异倍体细胞。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测

采用科蒂亚生物技术有限公司的Quanti VirusTM诊断试剂盒及Quanti VirusTM冷光仪进行E6/E7 mRNA表达的检测。将检测结果通过计算机转换为拷贝数，以拷贝数≥1copies/mL为阳性,<1copy/mL为阴性。

1.2.4阴道镜及病理学检查

对部分细胞学和(或)DNA倍体异常和(或)HPV E6/E7 mRNA检测阳性的妇女于阴道镜下行宫颈活组织检查。其病理学检查结果包括：宫颈癌、宫颈鳞状上皮内瘤变(CIN1、CIN2、CIN3/CIS)及正常或良性。

1.3统计学方法

数据分析采用统计软件SPSS 19.0，率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。以P<0.05为检验水准。

2结果

2.1 DNA倍体分析及组织病理学结果

980例经阴道镜下宫颈活检的ASCUS患者，CINⅠ及以上病变者458例。DNA倍体正常者369例，其中组织病理学诊断为CIN Ⅰ及以上病变者168例(45.5%)；伴1～3个DNA异倍体细胞者143例，CINⅠ及以上病变者38例(26.6%)；有>3个DNA异倍体细胞者468例， CIN Ⅰ及以上病变者216例(46.1%)。统计学分析发现，与DNA正常组相比，ASCUS伴DNA异倍体1～3个组发生CIN Ⅰ及以上病变者显著降低(χ12=15.399，P1=0.000)；而ASCUS伴DNA异倍体1～3个组发生CIN Ⅰ及以上病变者低于SCUS伴DNA异倍体>3个组比较，差异具有统计学意义(χ32=17.288，P3=0.000)，见表1。DNA倍体分析检测结果的灵敏度为84.1%，特异性为43.4%。

表1 980例ASCUS患者DNA倍体分析与宫颈病变之间的关系[n(%)]Table 1 Relationship between DNA ploidy analysis and cervical lesions in 980 patients with ASCUS[n (%)]

注：χ12、P1表示ASCUS伴DNA异倍体1～3个与DNA正常组相比；χ22、P2表示ASCUS伴DNA异倍体>3个与DNA正常组相比；χ32、P3表示ASCUS伴DNA异倍体1～3个与ASCUS伴DNA异倍体>3个相比。

2.2 HPV E6/E7 mRNA表达及病理检查结果

各组间的HPV E6/E7 mRNA阳性率有差异，其中CINⅠ及以上的HPV E6/E7 mRNA阳性率显著高于正常或良性组，差异具有统计学意义(χ2值分别为13.221，35.302，23.894，18.439，均P=0.000)，详见表2。HPV E6/E7mRNA表达检查结果的灵敏度为90.3%，特异性为49.6%。

2.3 DNA倍体分析联合HPV E6/E7 mRNA

DNA倍体分析联合HPV E6/E7 mRNA对CINⅡ及以上病变的检测结果的灵敏度为92.4%，特异性为32.7%，阳性预测值为41.0%，阴性预测值为89.5%，见表3。

表2 ASCUS患者HPV E6/E7 mRNA表达与宫颈病变之间的关系[n(%)]Table 2 Relationship between HPV E6/E7 mRNA expression and cervical lesions in ASCUS patients[n (%)]

注：χ12、P1表示CINⅠ与正常或良性相比;χ22、P2表示CINⅡ与正常或良性相比;χ32、P3表示CINⅢ与正常或良性相比，χ42、P4表示宫颈癌与正常或良性相比。

表3 DNA倍体分析联合HPV E6/E7 mRNA对CINⅡ及以上病变的检测结果[n(%)]Table 3 Detection results of DNA ploidy analysis combined with HPV E6/E7 mRNA for CIN II and above lesions[n (%)]

3讨论

目前推荐的有关宫颈癌的诊断是三阶梯的诊断程序，即细胞学-阴道镜-病理学。其中得益于细胞学检查的推广，近几十年来宫颈癌的发生率在全世界范围内都表现一个下降的趋势。尽管如此，但其特异性、敏感性及假阴性率都会使得可疑患者遭受不必要的痛苦。而且并非所有的癌前病变都会进展为浸润癌，国内学者研究显示低级别的病变可维持不变或自动逆转，仅约1/3未经治疗的高级别病变可能会在10年内发展成癌[4]。而ASCUS这一术语，它不仅包括与HPV 感染无关的宫颈上皮的良性改变，而且包括与HPV 感染密切相关的CIN 及宫颈癌，即细胞学报告为ASCUS时，其阴道镜下活检结果可以是正常宫颈，也可以是早期浸润癌[5],227例TCT结果为ASCUS患者中CIN的发生率为29.96%，其中高级别的CIN(CIN2和CIN3)的发生率为13.22%，组织病理结果为炎症的占70.04%。研究表明，ASCUS可能是发现高级别CIN的最早的信号[6-7]。目前，对ASCUS 的处理尚未形成统一的认识，推荐有三种处理方法:①立即行阴道镜下活检检查；②细胞涂片随访观察；③HPV检测。但对所有病例进行活不但会增加患者的负担与痛苦，而且也加大医师工作量；细胞学涂片随访又敏感性差且随访时间长；HPV检测可能导致漏诊。因此将DNA倍体分析、HPV E6/E7 mRNA与ASCUS病例结合，探索分流ASCUS患者的最佳方案。

3.1 DNA倍体分析与宫颈活检结果相比

细胞发生癌变时其细胞核内的DNA结构和含量会产生异常变化，导致DNA倍体状况发生改变，出现DNA异倍体细胞[8]。本研究在DNA倍体分析中发现，与DNA正常组相比，ASCUS伴DNA异倍体1～3个组发生CIN Ⅰ及以上病变者显著降低，差异具有统计学意义(P1=0.000)；而ASCUS伴DNA异倍体1～3个组发生CIN Ⅰ及以上病变者低于SCUS伴DNA异倍体>3个组比较，差异具有统计学意义(P3=0.000)，这与国内其他学者的研究结果相一致[9]。而国外学者所进行的回顾性研究结果认为对HR-HPV和DNA倍体分析均为阴性的患者，CINⅠ及以上病变可以1年后随访；而对于异倍体细胞为>5c细胞的患者则必须再次行细胞学检查和(或)阴道镜检查[10]。因此，建议经TCT诊断为ASCUS患者可行DAN倍体分析，若DNA倍体正常或为1～3个的患者可定随访或先行HPV检测，无需活检。但对于DNA倍体>3个者应立即行宫颈活检。

3.2 HPV E6/E7 mRNA与宫颈活检结果相比

HPV感染作为宫颈癌发生的主要危险因素，几乎所有的高级别CIN及宫颈癌都合并有HPV感染[11]。227例宫颈ASCUS患者中，HPV阳性组CIN的检出率高于HPV阴性组[6]。因此近年来，人们试图将HPV DNA检测用于ASCUS的分流处理。但HPV DNA检测存在一定的局限性，如不能区分宫颈进行性发展的HPV感染、退行性HPV感染及持续性HPV感染，且在凋亡细胞及细胞碎屑中也会出现阳性结果从而增加患者对宫颈癌的精神心理负担，甚至使得患者接受了过度治疗[12]。宫颈上皮细胞感染HR-HPV后，病毒癌基因,即HPV早期编码区中E6、E7基因的mRNA发生转录，生成两种癌蛋白E6、E7蛋白。E6、E7蛋白可与宿主细胞的抑癌基因p53和Rb蛋白等相结合，从而导致细胞周期的失常，进而使得宿主细胞恶性转化，导致癌变的发生[13-14]。因此HPV E6/E7 mRNA的检测能在宫颈组织中表现出癌基因活性[15]。对HPV E6/E7 mRNA进行检测不仅排除可疑或低度病变的能力强，而且对ASCUS患者的高级别病变具有较高辨别能力，能更好地筛选出高危人群，为临床医生提供比DNA检测更具有预测价值的检测结果[16]。故HPV E6/E7 mRNA检测应作为重点研究对象于2006年欧洲生殖器感染和肿瘤研究组织中取得共识[17]。因此，本研究采用HPV E6/E7 mRNA检测对ASCUS进行分流，结果显示CINⅠ及以上的HPV E6/E7 mRNA阳性率显著高于正常或良性组，差异具有统计学意义，这与国外学者Bello等[14]的结论相一致，他们研究发现对于高级别CIN，HPV E6/E7 mRNA检测具有有更好的特异性。但国内有研究发现HPV E6/E7 mRNA检测较HR-HPV DNA检测具有更高的特异性，但它们之间在CIN Ⅰ及以上级别的灵敏度上差异无统计学[18]。国内学者王华等[19]研究显示，宫颈病变程度越高，HPV E6/E7 mRNA的表达水平也越高，细胞学病变级别不同其CIN的mRNA表达也存在统计学差异。此外，本研究还发现对于CIN Ⅰ以下的病变者，HPV E6/E7 mRNA的阳性率低于CIN Ⅰ及以上病变者，因此认为HPV E6/E7 mRNA检测对于鉴别宫颈病变是短暂的宫颈异常还是将进一步发展有很大意义。

3.3细胞DNA倍体分析联合HPV E6/E7 mRNA与宫颈活检结果相比

本研究发现DNA倍体分析联合HPV E6/E7 mRNA对CINⅡ及以上病变检测结果的灵敏度为92.4%，特异性为32.7%。与两者单独检测相比较，两者联合的灵敏度有所提高。该理论尚需进一步的验证。

综上所述，对于ASCUS患者，临床医师需采取更为有效的检测方案用于ASCUS的分流处理，从而为避免对低风险人群的过度检查和治疗。其中DNA倍体分析及HPV E6/E7 mRNA的检测可协助临床医师减少对ASCUS患者的漏诊，同时也能避免给患者带来过度的检查及治疗，减少患者的痛苦及精神负担。

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