TAMs在HR-HPV诱发宫颈癌肿瘤微环境中的作用

王 珺，陈 星

(浙江省台州医院妇产科，浙江 临海 317000)

宫颈癌是临床上常见的疾病，属于我国女性第二恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，严重影响我国女性健康。现代流行学调查结果表明：全球每年新发46.6万宫颈癌，而约13.15万在我国，且我国每年有3～5万人死于宫颈癌[1]。宫颈癌发病机制复杂，目前普遍认为与高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)感染有关，且90.0%以上宫颈癌患者中能检测到HR-HPV。此外，HR-HPV病毒感染还容易增加头颈部癌、肺癌、肛门等肿瘤[2]。国内学者研究表明：肿瘤微环境协同致癌、肿瘤进展，该过程中会引起机体免疫功能的抑制或失活[3]。肿瘤相关的巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是宫颈癌患者肿瘤微环境中含量最多的免疫群体，可能在宫颈癌的发生、发展中发挥作用。研究表明宫颈癌患者发病后在多种激活机制作用下可能会对机体免疫反应产生有效的抑制作用，从而能阻止机体对于HR-HPV的清除和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)的消退，增加疾病的发生、发展，肿瘤微环境中的TAMs促进肿瘤的进展[4]。由此提出假设：HR-HPV相关的宫颈癌肿瘤微环境中TAMs的活化和功能是以M2功能为主，它们协同作用可引起HR-HPV持续感染所致的宫颈癌前病变及随后发生的宫颈癌[5]。但是，临床上对于宫颈癌患者发生时肿瘤微环境中的TAMs的状态对宫颈癌的发生发展的关系尚不完全知晓。因此，本课题以2014年12月至2017年6月宫颈癌患者100例、癌前病变30例及健康体检者30例作为研究对象，探讨TAMs在HR-HPV诱导的宫颈癌肿瘤微环境中的作用，报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选择浙江省台州医院妇产科2014年12月至2017年6月宫颈癌患者100例，设为宫颈癌组，年龄24～81岁，平均47.94±7.81岁。患者中鳞癌74例，腺癌21例，腺鳞癌5例。分化程度：高分化32例，中分化40例，低分化28例。临床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期39例。淋巴结：转移35例，未转移65例。选择同期入院治疗的宫颈癌前病变患者30例，设为癌前病变组，年龄(26～79)岁，平均(46.15±7.86)岁。CINⅠ级9例，CIN Ⅱ～Ⅲ级21例。选择同期检查的健康体检人群30例，设为健康组，年龄26～82岁，平均(48.58±8.05)岁。本课题均得到医院伦理委员会同意，患者及家属对检查方案具备知情权。

1.2纳入及排除标准

纳入标准：①符合《妇产科学》[6]第8版教科书中关于宫颈病变、宫颈癌临床诊断标准者；②最终均经过宫颈活检或手术检查最终得到确诊；③标本采集前均未进行化疗、免疫及放射治疗。

排除标准：①经手术或组织病理学检查未能确诊者或疑似病灶者；②合并严重心、肝、神功能异常或影响肿瘤微环境者；③难以遵循医嘱完成相关检查及治疗者。

1.3仪器及设备

DNA合成仪，DNA测序仪，PCR仪，快速电泳仪，高速低温离心机，离心机，电子显微镜，细胞反应器等现代化实验仪器，见表1。

表1 仪器与设备Table 1 Instruments and equipment

1.4方法

1.4.1病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs表达检测

免疫组化检测HR-HPV+标本的E2、E5、E6、E7、TAMs的表达：取上述标本，浸泡在10%甲醛溶液中固定，取出固定后的组织石蜡包埋后制备4μm病理切片，1h烘烤，温度60℃，脱蜡后利用PBS进行2次冲洗，保证整体溶液pH值为7.2～7.4，将标本放置在3%H2O2溶液中20min孵育，消除组织中过氧化物，PBS冲洗3次，每次连续冲洗3min，向溶液中根据1:10比例加入山羊血清，孵育15min，去除组织中的血清，滴加抗鼠E2、E5、E6、E7、TAMs单克隆抗体，放置在4℃下24h，常温下1h，PBS冲洗3次，每次5min，加入生物素标记的E2、E5、E6、E7、TAMs二抗，37℃下孵育30min，利用DAB显色，苏木精8～10s复染，中性树胶封片。在200倍光镜下每张切片随机选择5个视野，观察切片中阳性细胞数占总细胞数的比例，每个视野测定3次后取平均值，倒置显微镜下完成不同病理切片组织的显色反应，E2、E5、E6、E7在切片表明呈观察不同组织的显色反应情况。

1.4.2宫颈癌组CD14 、CD163、CD206、CD68表达检测

采用流式细胞仪测定宫颈癌组织与癌旁组织CD14、CD163、CD206、CD68水平，有关操作严格遵循仪器操作说明书完成。主成分分析：检测不同标本中差异基因表达，转录组学进行功能分析，利用R软件包分析。对获得的基因完成GO，KEGG，PATHWAY 的分析。根据表面表达的因子区分M1/M2基因。取上述标本，提取RNA，定量定性检测，使用Agilent 公司的microarray 芯片4*44K人类全长基因组芯片，检测差异基因的表达，转录组学分析，主成分分析，热图分析，GO，KEGG，PATHWAY 分析等，筛选出M的因子，M1/M2因子：M1为趋化因子(C-C基序)配体5(chemokine C-C motif ligand5，CCL5)、趋化因子(C-C基序)配体9(chemokine C-C motif ligand9，CCL9)、白细胞介素-2RA(interleukin-2RA，IL-2RA)；M2为趋化因子(C-C基序)配体18(chemokine C-C motif ligand18，CCL18)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)。

1.4.3 M1/M2因子的表达检测

采用实时荧光定量(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR法)测定3组M1/M2因子的表达。采用反转录试剂盒(ABI公司生产提供)完成miRNA的反转录，保证反转录整个体系为15μL，通过查阅Sanger micro-RNA序列获得M1/M2相应的序列引物，根据每一位标本情况设置反转录条件：16℃30min，42℃30min，85℃5min，最后在4℃保持恒温，将获得的反转录产物采用RT-PCR系统完成定量检测，保证整个反应体系为20μL，设置PCR检测反应条件：95℃10min，95min15s，60℃1min，连续进行40个循环。最后通过PCR自带软件获得基线与阈值后，设置内参，读取相应M1/M2循环阈值，计算两种循环阈值，采用2-循环阈值表示M1/M2表达水平。

1.5观察指标

①E2、E6、E5、E7和TAMs阳性率：观察3组标本E2、E6、E5、E7和TAMs阳性率情况；②CD14，CD163，CD206，CD68：观察宫颈癌组患者肿瘤组织与癌旁组织CD14，CD163，CD206，CD68表达水平；③主要分析;观察3组不同标本主要成分情况；④M1/M2因子的表达。观察3组标本M1/M2因子的表达情况。

1.6统计学方法

2结果

2.1三组病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs阳性率比较

三组病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs阳性率均存在显著性差异(均P<0.05)，宫颈癌组最高，癌前病变组次之，健康组最低，见表2。

表2 三组病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs阳性率[n(%)]Table 2 Positive rate of viral proteins E2, E6, E5, E7 and TAMs among three groups[n(%)]

2.2 两组CD14、CD163、CD206、CD68阳性率比较

宫颈癌组织中CD14、CD163、CD206、CD68阳性率均高于宫颈癌旁组织(均P<0.05)，见表3。

表3 宫颈癌组CD14，CD163，CD206，CD68阳性率比较[n(%)]Table 3 Comparison of positive rates of CD14, CD163, CD206 and CD68 in cervical carcinorna group [n (%)]

2.3三组主成分分析

从主成分分析中，可以看出宫颈癌组的基因表达与健康组和癌前病变组明显不同，而且各组基因没有相关性，见图1。

图1 三组组织标本主要成分分析Fig. 1 Analysis of principal components of tissue specimens in three groups

2.4三组标本M1/M2因子的表达情况比较

通过SAM 分析(监督分析)聚类，调控基因的表达，共筛选出375个有显著差异的基因，看不同基因在样本中差异表达趋势，有的基因上调，有的基因下调，FC是差异倍数，越接近+5，说明基因上调，越接近-5，说明基因下调。宫颈癌组、癌前病变组和健康组不同的基因表达有差异(F=5.361，P<0.05)，见图2。

图2三组标本M1/M2因子的表达情况比较
Fig. 2 Comparison of expression of M1/M2 factors of specimens among three groups

3讨论

3.1宫颈癌发生机制

宫颈癌是临床上常见的疾病，属于是一种高发的恶性肿瘤，其发生、发展是一个多因素、多节段共同参与过程。文献报道显示：HR-HPV持续感染是引起宫颈癌的主要原因，尤其是以HPV16/18为主[7]。当机体感染HPV后宿主细胞将会持续处于游离状态或整合状态，而HPV-DNA整合则是HPV致癌的主要原因。多数HR-HPV DNA能整合到宿主细胞基因组中，引起基因发生不同程度的缺失、突变，导致机体内的促癌基因与抑癌基因平衡受到打破，逐渐演变为宫颈癌。

3.2肿瘤相关巨噬细胞在宫颈癌中的作用机制

文献报道显示：肿瘤微环境相对复杂，包括：免疫反应的网络系统、血管生成因子[8]。而TAMs则是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的生长、发展过程中会引起大量的TAMs发生浸入。从大的角度来说，TAMs主要源于循环血液中单核细胞分化中。本研究中，三组病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs阳性率均存在显著性差异(均P<0.05)，宫颈癌组最高，癌前病变组次之，健康组最低。TAMs的稳态是由局部组织的单核细胞的增殖所调控的，弹性与多样性是巨噬细胞类型的两大特点，遇到外界刺激的情形下(例如微生物入侵，组织损伤，细胞因子信号以及代谢产物等)，巨噬细胞也分为M1、M2两种极化类型，分别参与了Th1与Th2的免疫效应过程。本研究中，宫颈癌组宫颈癌组织中CD14、CD163、CD206、CD68阳性率均高于癌旁组织(均P<0.05)。TAMs存在M1/M2二种活性及极化形态，并与血管新生、肿瘤浸润及不良预后相关。M1型即经典活化性巨噬细胞(Mφ)，M2型替代性活化的Mφ。肿瘤微环境中，巨噬细胞浸润肿瘤基底膜破溃处，基底膜破溃是肿瘤细胞侵入周围基质的必需前提；其次，巨噬细胞释放细胞因子和趋化因子，促进肿瘤细胞的侵入；TAMs在肿瘤微环境中被修饰，失去了吞噬肿瘤细胞或者将肿瘤细胞呈递给T细胞的能力，极化的Mφ进一步影响局部免疫反应，与各种因子协同作用，调节病原体的生物感染结局、肿瘤免疫、参与免疫调节和组织的修复。本研究中，通过SAM 分析(监督分析)聚类，调控基因的表达，共筛选出375个有显著差异的基因，看不同基因在样本中差异表达趋势，有的基因上调，有的基因下调，FC是差异倍数，越接近+5，说明基因上调，越接近-5，说明基因下调。宫颈癌组、癌前病变组和健康组不同的基因表达有差异(P<0.05)。

综上所述，肿瘤相关的巨噬细胞在高危型人乳头瘤病毒诱导的宫颈癌肿瘤微环境中发挥了重要的作用，干扰机体免疫水平，促进疾病的发生、发展。

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[4]García-Rocha R,Moreno-Lafont M,Mora-García M L,etal.Mesenchymal stromal cells derived from cervical cancer tumors induce TGF-β1 expression and IL-10 expression and secretion in the cervical cancer cells, resulting in protection from cytotoxic T cell activity[J].Cytokine,2015,76(2):382-390.

[5]俞青青, 唐荣军, 楼军,等. 同步热放化疗治疗在中晚期宫颈癌的应用价值[J]. 中国妇幼健康研究, 2015, 26(4):794-797.

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[专业责任编辑：张忠明]