早期新生儿不明原因严重高胆红素血症基因筛选

魏 萌，李 菁，杨丽菲，胡 瑞

(上海儿童医学中心新生儿科，上海 200217)

高胆红素血症是新生儿最常见的疾病之一。60%～80%的新生儿会发生黄疸或新生儿高胆红素血症，至今临床上仍有约50%黄疸患儿的病因不明确[1]。部分新生儿严重时可发展为急性胆红素脑病(acute bilirubin encephalopathy，ABE)或核黄疸，将显著增加新生儿死亡率，幸存的新生儿可能会出现长期的神经系统后遗症，如脑瘫、耳聋、智力障碍或严重发育迟缓等。现有的临床指南建议，早期发现新生儿患严重高胆红素血症的风险，可利于及时、有效地预防相关并发症的发生。引起新生儿重症高胆红素血症的原因很多，形成因素也较为复杂，往往是多种因素综合作用的结果。近年我国对新生儿高胆红素血症临床原因的分析较多。2009年北京儿童医院新生儿中心研究发现，重症高胆红素血症的危险因素中临床最常见的是感染，其次是原因不明、早产、溶血、窒息、头颅血肿、遗传代谢病。临床上，很多不明原因的黄疸与基因改变有关。目前关于新生儿黄疸基因研究主要集中在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1 Al，UGTlAl)基因多态性方面。

据此，在不明原因高胆红素血症患儿中通过评估家族史、基因监测等发现基因突变人群，对这类患儿进行长期随访，同时对这类患儿家属今后生育子女及早采取预防措施是降低胆红素脑病发生的有效途径之一，也可进一步深入研究不明原因严重高胆红素血症的发生机制。

1对象与方法

1.1研究对象

对上海儿童医学中心新生儿科2015—2016年收治的严重高胆红素血症59例患儿进行分析，以探讨UGT1A1基因突变与新生儿不明原因严重高胆红素血症的相关性。根据对光疗的反应将59例患儿分为难治性高胆红素血症组(难治组)和非难治性高胆红素血症组(非难治组，难治性：光疗8h后，血清胆红素下降小于5mg/dL或黄疸退而复现，再次达到光疗或者换血标准)。纳入标准：原因不明，出生14d之内，重症高胆红素血症血清胆红素峰值达342mol/L以上，以非结合胆红素增高为主，非结合胆红素占总胆红素的80%以上的足月患儿。患儿入院时家属即签署知情同意书。排除标准：生后>14d、新生儿溶血病、新生儿窒息、先天性心脏病和消化道畸形引起摄入不足、感染、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏、头皮血肿、出血性疾病、使用影响胆红素代谢的药物、胃肠外营养及患儿乙肝表面抗原阳性或其他肝脏疾病；监护人拒绝行基因检测的；研究者认为有不适合参加试验的任何其他情况。

1.2研究方法

本研究为非随机对照试验。通过监测外周血白细胞基因组DNA UGT1A1测序，了解不明原因高胆红素血症患儿UGT1A1突变发生率及类型，比较不明原因的难治性严重高胆红素血症患儿和非难治性严重高胆红素血症患儿UGT1A1基因突变的发生率的差异。基因检测：采外周静脉血2～4mL，设计UGT1A1基因PCR扩增引物，采用Taq DNA聚合酶试剂盒对DNA样本UGT1A1基因(外显子及其侧翼序列)扩增，扩增后电泳条带特异，ABI3100测序仪Sanger测序；试验中止标准：原因不明严重高胆红素血症患儿相关实验检查回报，找到明确病因者，予以剔除。收集患儿一般资料：性别、胎龄、分娩方式、出生体重、Apgar评分、日龄、喂养方式、生长发育情况等。

1.3统计学方法

应用SPSS 17.0软件包对数据进行整理分析。计量数据资料用均数±标准差表示，正态分布方差齐性计量资料采用t检验；非正态分布或方差不齐计量资料采用Mann-Whitney秩和检验。计数资料用例数、百分比描述，分析采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义，见表1。

2结果

2.1一般情况

在59例患儿中，难治组47例，非难治组12例。两组间一般情况比较未见明显统计学差异(均P>0.05)，见表1。

表1 基本资料比较Table 1 Comparison of basic

2.2两组间基因突变类型分析

难治组中检测到UGT1A1基因纯合突变5例，全部均为G71R纯合突变；检测到杂合突变共29例，其中G71R杂合突变26例，突变频率为65.957%(31/47)，为热点突变点。26例G71R突变中21例不伴有UGT1A1基因其他位点突变。c.1091C>T,p.P364L杂合突变4例，突变频率为8.511%(4/47)；检测到c.529 T>C,p.Cys177Arg 杂合突变1例；检测到c.1352C>T,p.P451L 杂合突变1例；检测到c.456T>G,p.Tyr486Asp杂合突变 1例；发现2例c.536T>A,p.Leu179Gl杂合突变，这是既往未报道过的新的UGT1A1突变位点。8例未检测到基因突变。

非难治组中检测到UGT1A1基因纯合突变2例，全部均为G71R纯合突变。检测到杂合突变共7例，其中G71R杂合突变6例，突变频率为66.667%(8/12)，为热点突变点；6例G71R突变中5例不伴有UGT1A1基因其他位点突变。c.1091C>T,p.P364L杂合突变1例，突变频率为8.333%(1/12)；检测到c.1352C>T,p.P451L 杂合突变1例；3例未检测到突变。两组间基因突变无明显统计学差异，见表2。

表2 两组基因突变比较[n(%)]Table 2 Variance analysis of gene mutation between two groups[n(%)]

2.3 UGT1A1不同突变基因组比较

将UGT1A1突变分为无突变、纯合突变、杂合突变三组，对比患儿一般情况，发现患儿入院日龄在无突变组与纯合突变组之间有差异，F=4.4831，P<0.05；患儿出院黄疸值在纯合突变组和杂合突变组之间有差异，F=3.4423，P<0.05，见表3。

表3 不同基因组的患儿一般资料比较Table 3 Comparison of general information among children of different gene

注：*无突变组与纯合突变组比较，P<0.05；**纯合突变组与杂合突变组比较，P<0.05。

3讨论

UGT1A1是胆红素在肝脏结合的关键酶，可使胆红素与葡萄醛酸结合形成结合胆红素，UGT1A1缺陷可导致非溶血性高未结合胆红素血症。UGT1酶的编码基因定位于2号染色体长臂37区8带(2 q 378)，它由4个共同外显子和1个多变的第一外显子构成，UGT1A1就是由第一外显子A1和4个共同外显子(2～5外显子)组成的复合体。UGT1A1启动子是一非编码区，它存在于上游调节区，有调节基因表达的作用，它包含TATA盒，可精确调节转录起始的DNA序列。纯合子UGT1A1基因启动子(TA)7TAA突变可导致酶的活性明显下降，这种UGT1A1基因启动序列多态性变化与白种人和亚洲马来西亚新生儿高胆红素血症相关，但日本人和中国台湾新生儿高胆红素血症却与UGT1A1基因Gly71Ary突变(UGT1A1基因第一外显子211位核苷酸G被A替代，导致71位氨基酸Gly被Arg取代)相关，表明与新生儿高胆红素血症相关的UGT1A1基因突变的位点，不同种族之间存在差异[2]。

3.1两组间基因突变类型分析

本研究发现难治组与非难治组严重高胆红素血症新生儿中G71R突变频率分别为65.957%和66.667%，提示我国严重高胆红素血症汉族新生儿UGT1A1基因中仍以G71R突变为主。有研究发现，在日本、韩国、中国等亚洲国家黄疸新生儿中的G71R是最常见的UGT1A1突变类型，G71R多态性位点的纯合突变和杂合突变可使转移酶活性下降[3]。这与本研究结果一致。

决定高胆红素血症不良预后的是胆红素脑病[4]。该病不仅可导致中枢神经系统损害，甚至可导致死亡。胎龄>35周新生儿血清总胆红素(serum total bilirubin,TSB)水平在342～427μmol/L时有核黄疸病例报道，G-6-PD缺乏症患儿黄疸出现时间早、进展快，胆红素峰值高，且易并发胆红素脑病[5]，足月儿TSB水平达427μmol/L时即高度提示可能发生高胆红素血症，需行头颅MRI及脑干听觉诱发电位等检查。目前，越来越多的研究开始探究重度及极重度高胆红素血症的突变基因类型。

3.2本研究的必要性和局限性

大部分病理性黄疸如能及时去除病因、给予光疗或者换血，预后较好。在临床工作中，经常遇到经过光疗后黄疸消退效果不佳及黄疸退而复现的新生儿，对于这一部分难治性严重高胆红素血症新生儿，一旦形成胆红素脑病，后果严重。故及时寻找病因，积极预防，早期干预及治疗尤为重要。本研究对比了难治性严重高胆红素血症新生儿和非难治性高胆红素血症新生儿基因突变类型及发生率，未发现显著差异。因时间及条件限制，本次研究样本量仍太小，故两组间是否存在差异，仍需进一步研究。虽然本研究对比难治性与非难治性严重高胆红素血症新生儿一般情况及基因突变类型未发现明显统计学差异，但我国人口众多、民族丰富，构成了基因多态性的丰富资源。了解种族背景、家族史以及相关的基因学研究，对早期新生儿严重高胆红素血症的筛查和治疗是非常有必要的。

3.3新的突变位点及未来研究方向

在本研究中还发现2例新的UGT1A1基因突变位点，c.536T>A,p.Leu179Gl杂合突变，既往国内外文献未曾报道此位点基因突变与新生儿高胆红素血症的相关性，是否为新生儿高胆红素血症致病基因突变还有待进一步研究论证。除此之外，Watchko[6]研究发现G6PD、UGT1A1、OATP2等基因均可能是引起严重高胆红素血症的危险因素。2009年Boony等认为G6PD突变而非G-6-PD酶活性水平的改变是严重高胆红素血症的危险因素。Azlin等于2011年研究发现UGT1A1是独立于G6PD缺乏之外的马来西亚人群严重高胆红素血症的危险因素，但其是否增加其他遗传因素的风险并不明确。尽管本研究纳入的病例已排除G-6-PD酶活性异常的新生儿，但尚需对G6PD、OATP2等基因的改变进一步分析研究。这也是未来工作研究的重点。

[1]李军,李贵南,吴运芹,等.胆红素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因突变类型与新生儿高胆红素血症的相关性分析[J].中国新生儿科杂志,2016,31(1):28-31.

[2]石航婷,龙隽,邓俊彪,等.UGT1A1基因多态性分析与新生儿高胆红素血症的关系[J].中国新生儿科杂志,2013,28(1):21-24.

[3]Yu Z,Zhu K,Wang L,etal.Association of neonatal hyperbilirubinemia with UGT1A1 gene polymorphisms: a meta-analysis[J].Med Sci Monit,2015,21:3104-3114.

[4]Canu G,Minucci A,Zuppi C,etal.Gilbert and Crigler Najjar syndromes: an update of the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) gene mutation database[J].Blood Cells Mol Dis,2013,50(4):273-280.

[5]钟元枝,刘玲,肖体海,等.新生儿G-6-PD缺乏症合并高胆红素血症的临床分析[J].中国妇幼健康研究,2017,28(1):69-71,80.

[6]Watchko J F.Genetics and pediatric unconjugated hyperbilirubinemia[J].J Pediatr,2013,162(6):1092-1094.

[专业责任编辑：艾 婷]