精胺上调大鼠心肌缺血再灌注时beclin-1的表达*

董　杰，刘振华，韩丽萍

(温州医科大学低氧医学研究所，浙江 温州 325035)

心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤是导致诸如中风和心肌梗死等疾病发病和致死的主要原因。尽管溶栓药物或经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention，PCI)等临床治疗成功使得阻塞的血管再通，但仍有很多问题待解决[1]。数据显示，血管再通后，无复流(no-reflow，NR)现象发生率可达50%[2]。缺血再灌注后的无复流现象既是心肌损伤、梗死延展的标志，也是心室重构和心功能障碍的预测指标[3]。精胺(spermine，SP)属脂肪胺类小分子化合物，广泛分布在几乎所有原核及真核生物的组织细胞内，在细胞增长、增殖和分化方面发挥重要作用。Madeo等[4]的报道提出，精胺可在培养的酵母细胞、多种哺乳动物细胞、线虫以及果蝇体内诱导自噬发生，并延长细胞寿命。自噬(分为基础自噬和诱导自噬)是真核细胞中进化上高度保守的、用于降解和回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的过程，而诱导自噬是各种应激状态下的自我保护机制。我们之前的在体研究发现结扎大鼠冠状动脉左室前降支30 min后，再灌注数小时可使多胺代谢失衡，精胺和精脒减少[5]，因此我们推测外源性补充精胺可能通过在缺血/再灌注中诱导自噬而发挥心肌保护作用，进而防止或减轻无复流现象。故本实验给予再灌注大鼠外源性精胺，观察其是否具有保护心肌、减轻无复流的作用，并通过测定beclin-1表达来探讨该作用机制是否与诱导自噬相关。

材　料　和　方　法

1　动物

SD大鼠由温州医科大学动物中心提供，合格证编号为SCXK(京)2016-0011，体重(240±20)g,雌雄不拘，按体重从大到小排序，按随机数字表法分为3组：假手术对照组(control 组)、缺血-再灌注组(IR组)和精胺干预组(IR+SP组)，每组10只。

2　主要试剂

精胺(Sigma)； thilflavin S(Bioluminor)； Evans blue (Abcam)； TTC染液(南京建成生物公司)；大鼠肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒均购自R&D；Western blotting细胞裂解液(Beyotime)；抗GAPDH抗体和抗beclin-1抗体(Santa Cruz)。

3　主要方法

3.1大鼠心肌缺血再灌注模型的制备1% 戊巴比妥钠35～40 mg/kg腹腔注射以麻醉大鼠，切开气管，连接呼吸机辅助呼吸。开胸暴露心脏，剪开心包，于冠状动脉左室前降支离左心耳下缘约0.15 cm处绕左室支穿线结扎，缺血30 min后剪开结扎线，再灌注60 min，造成心肌缺血-再灌注损伤。术中连续监视ECG Ⅱ导联的变化，以ST段明显抬高为结扎成功(心肌缺血)的指标，剪开结扎线后ST 段下降1/2 以上表明复灌成功。缺血再灌注组不做其它处理；精胺干预组于再灌注前15 min时尾静脉注射 0.5 mmol/L 精胺 (2 mL/kg)；假手术组实施开胸手术并穿线，但不结扎。

3.2各组大鼠心律失常发生率的测量采用标准肢体Ⅱ导联连续监测各组大鼠心电图变化，重点观察室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)、室性纤维颤动(ventricular fibrillation，VF)、室性异位节律(ventricular ectopic beats，VEBs)及房室传导阻滞(atrial ventricular block，AVB)的发生率和心律失常持续时间。

3.3光镜下观察心肌组织形态结构再灌注结束后，取左心室组织切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，置于4%多聚甲醛中固定，常规脱水、浸蜡、包埋，制成光镜切片，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。

3.4血浆cTnI和CK-MB的检测再灌注结束后，以肝素处理过的注射器心脏穿刺法采血2 mL，4 ℃低速离心，取上层血浆用酶联免疫试剂盒分别测定cTnI与CK-MB的含量。

3.5心肌无复流面积的测定恢复灌注后经导管注入左心室6% thioflavin S溶液(1 mg/kg)。Thioflavin S 可发出荧光，用以标记再灌注心肌。再次结扎原冠脉，并经导管注入左心室Evans 蓝溶液(1 mg/kg)。迅速取出心脏，分离左心室，快速深低温冷冻。取出冷冻心脏，沿房室沟平行切为8～10层。未被蓝色染色的心脏为结扎冠脉供血范围的心肌；在紫外灯下无荧光的心肌为无复流心肌，后者与前者的比例为无复流所占的比例。

3.6心肌组织MPO活性的检测再灌注结束后，取缺血区心肌组织，称重后置于匀浆器内，剪碎，制备匀浆。3 000 r/min离心15 min后，取上清液，用酶联免疫试剂盒测定各组MPO的活性。

3.7Western blot检测心肌组织beclin-1蛋白的表达再灌注结束后，取各组大鼠左心室缺血区组织，提取总蛋白，并用Bradford法对提取的蛋白进行定量。每个样本取等量蛋白(60 μg)进行10% SDS-PAGE，然后转印至硝酸纤维素膜上。该膜在含8%脱脂奶粉的封闭液中封闭37 ℃ 1 h后,加入稀释的抗beclin-1抗体4 ℃孵育过夜。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶标记的Ig抗体室温轻摇1 h，洗膜后显迹，同时用GAPDH作为内参照。

4　统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，各组数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，多样本均数之间的两两比较用SNK-q检验，两组间比较用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　外源性精胺减少大鼠IR后心律失常的发生

大鼠心肌缺血后ST段明显抬高，再灌注过程中，VT和VEBs等心律失常现象均有发生；精胺组大鼠心肌再灌注性心律失常发生率显著降低，且持续时间缩短(P<0.05)；假手术对照组未见再灌注心律失常发生，见表1。

表1　外源性精胺对大鼠再灌注性心律失常的影响Table 1.The effect of spermine on the arrhythmia during reperfusion in rats (Mean±SD.n=10)

*P<0.05vsIR group.

2　各组心肌组织形态结构的变化

光镜下可见对照组心肌肌丝排列整齐，闰盘清晰，无炎症细胞浸润；IR 组可见部分心肌细胞呈凝固性或带状坏死；IR+SP组炎症细胞浸润减少，未见其它病理改变，见图1。

Figure 1.The morphological changes of myocardial tissues assessed by HE staining (×40).A:control group; B:IR group; C:IR+SP group
图1HE染色检测光镜下各组心肌的形态学改变

3　外源性精胺降低血浆心肌损伤标志物的含量

酶联免疫试剂盒检测结果显示，IR组血浆中2种标志物的含量均显著高于对照组(P<0.05)；与IR组相比，IR+SP组血浆中CK-MB和cTnI的含量则显著降低(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The plasma levels of cTnI and CK-MB assessed by ELISA.Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsIR group.
图2各组大鼠血浆中cTnI和CK-MB的含量

4　外源性精胺减少无复流面积

如图3所示，IR组心肌出现了明显的无复流区，而IR+SP组无复流范围则显著减少，无复流区占缺血区的面积比(NR/ischemia)显著降低(P<0.05)。

Figure 3.No-reflow (NR) size measurement.Mean±SD.n=10.*P<0.05vsIR group.
图3IR组与IR+SP组无复流面积的比较

5　外源性精胺降低心肌组织匀浆中MPO的活性

酶联免疫试剂盒检测结果显示，IR组心肌组织中MPO的活性较假手术对照组明显升高；与IR组相比，IR+SP组MPO的活性减少(P<0.05)，见图4。

6　外源性精胺上调心肌beclin-1的表达

Western blot结果显示，自噬标志蛋白之一beclin-1的表达在心肌缺血再灌注后有所升高(P<0.05)，而SP可以使beclin-1的表达进一步上调(P<0.05)，见图 5。

讨　　论

心肌梗死是威胁人类健康的难治性疾病之一，其治疗宗旨是尽早再通阻塞的血管以恢复缺血组织的供血，即再灌注。但数据显示，即便是血管成功再通后，仍有患者出现梗死面积扩大、心功能恶化以及梗死心室重塑加重的现象，无复流现象无疑是导致该结果的重要原因之一。关于无复流现象，早在上个世纪九十年代就已受到了国内外的关注，但成果并不理想。

Figure 4.The activity of MPO assessed by ELISA.Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsIR group.
图4各组大鼠心肌组织匀浆MPO活性的比较

Figure 5.The results of Western blot for determining the protein levels of beclin-1 in different groups.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsIR group.
图5各组大鼠心肌组织中beclin-1蛋白的表达水平

多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)激活后释放活性氧和溶酶体蛋白酶如弹性蛋白酶等，损伤内皮细胞膜，导致内皮细胞层器质性的损害，是导致IR损失以及无复流现象的重要原因之一[6]。MPO是PMNs的特异性标志物，通过测定MPO 的活性即可灵敏、定量地反映PMNs的含量及其在组织中的浸润。本实验结果显示，再灌注大鼠心肌组织MPO活性显著增高，而SP组的MPO活性比IR组减少了33%，无复流面积也明显减少，提示外源性精胺可能通过抑制减少PMNs的心肌浸润，抑制炎症反应而保护心肌，但具体机制尚待进一步研究。

另外，有研究表明在肥胖症患者的脂肪组织中，自噬可以通过减少炎症相关基因的表达而限制炎症反应[7]，并与内皮细胞的稳态和血管重构等密切相关[8]。最新研究发现，niclosamide通过自噬途径减少炎症细胞因子，从而改善肾脏缺血/再灌注损伤的结果[9]。为了验证本实验中外源性精胺抑制炎症反应的作用是否是通过自噬实现的，我们检测了自噬的“守门人”beclin-1蛋白的表达。本实验结果显示，IR组的beclin-1表达略微上调，这可能是损伤诱导的自噬，是一种保护性应激反应。而外源性精胺显著上调该蛋白的表达，提示精胺可能通过诱导自噬发生而抑制了心肌的炎症反应，减少PMNs心肌浸润，从而减轻了心肌缺血再灌注后心肌无复流现象的发生。虽然欲确定精胺与自噬的关系还需深入研究，但本实验的研究结果成果为进一步研究奠定了理论基础，为防治无复流现象提供了新的靶点。

[参考文献]

[1]Walters AM,Porter GA Jr,Brookes PS.Mitochondria as a drug target in ischemic heart disease and cardiomyopathy[J].Circ Res，2012,111(9):1222-1236.

[2]Jaffe R,Charron T,Puley G,et al.Microvascular obstruction and the no-reflow phenomenon after percutaneous coronary intervention[J].Circulation,2008,117(24):3152-3156.

[3]Niccoli G,Spaziani C.Serotonin:another player in the complex pathogenesis of no-reflow phenomenon[J].Ana-dolu Kardiyol Derg,2010,10(3):260-262.

[4]Madeo F,Eisenberg T,Büttner S,et al.Spermidine:a novel autophagy inducer and longevity elixir[J].Auto-phagy,2010,6(1):160-162.

[5]韩丽萍，姜春明，徐长庆，等.精胺减轻大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的作用及机制初探[J].中国病理生理杂志,2007,23(5):839-843.

[6]Tritto I,Zuchi C,Vitale S,et al.Therapy against reperfusion-induced microvascular injury[J].Curr Pharm Des,2013,19(25):4586-4596.

[7]Jansen HJ,van Essen P,Koenen T,et al.Autophagy activity is up-regulated in adipose tissue of obese individuals and modulates proinflammatory cytokine expression[J].Endocrinology,2012,153(12):5866-5874.

[8]Sachdev U,Lotze MT.Perpetual change:autophagy,the endothelium,and response to vascular injury[J].J Leukoc Biol,2017,102(2):221-235.

[9]Zhang LX,Zhao HJ,Sun DL,et al.Niclosamide attenuates inflammatory cytokines via the autophagy pathway leading to improved outcomes in renal ischemia/reperfusion injury[J].Mol Med Rep,2017,16(2):1810-1816.