3个Stargardt家系ABCA4基因致病突变位点的筛查及验证

王　悠，金学民

郑州大学第一附属医院眼科 郑州 450052

Stargardt病(Stargardt disease, STGD)是最常见的青少年黄斑发育不全遗传病，为常染色体隐性遗传，罕见显性遗传[1]，多于青少年期起病，极少数患者于50岁后才有临床表现[2]。该病特点是中心视力呈进行性下降，双眼视网膜色素上皮渐进性萎缩，眼底检查常表现为黄斑萎缩，常在后极部有典型的黄白色鱼尾样斑点蔓延，有时也可出现在视网膜赤道部[2]。典型的眼底造影表现为脉络膜湮灭征，这是由于堆积在视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium,RPE)的脂褐素遮蔽了脉络膜荧光所致。疾病进一步进展则可表现出视网膜电图(electroretinogram，ERG)异常。STGD人群发病率1/10 000，常见于近亲结婚的后代，同胞中可有多人发病。95%以上的STGD与ABCA4基因 (OMIM:601691; GenBank:NG_009073.1)的异常有关[3-5]，但不同患者ABCA4基因的突变位点不同，故本研究对3个STGD家系的ABCA4基因进行了筛查和突变定位。

1　对象与方法

1.1研究对象3例来自不同家系的STGD先证者由郑州大学第一附属医院、河南省立眼科医院于2015至2017年门诊收集，随后又于其中2个家系中各发现1例STGD患者，均经由眼底病专家评估后确诊。临床诊断依据包括：起病于青少年期；双眼中心视力进行性严重下降，配镜矫正后无法提高或提高不明显；黄斑萎缩或营养不良，裂隙灯下表现为击铜样眼底或大片萎缩斑；视网膜血管管径正常；典型的脉络膜湮灭造影结果并不作为必需的诊断依据，但具有重要的参考价值[6]。本研究获患者及监护人的知情、同意。

1.2一般检查对所有患者进行如下眼科检查和评估：采集病史，双眼验光诊断视力，眼底彩色照相，对适龄患儿行荧光素钠眼底血管造影(FFA)，多焦视网膜电图(mfERG)，光学相干断层成像(OCT)。

1.3ABCA4基因筛查、突变定位及验证采集患者及家庭成员外周静脉血5 mL，封存于EDTA抗凝管中并提取基因组 DNA，构建基因组文库，然后利用迈基诺公司(北京)基因捕获技术捕获与富集ABCA4基因的外显子及相邻内含子区域(约50 bp)，质量控制后利用高通量测序仪(Illumina Nextseq500)进行测序。测序数据先去除低质量reads、连续的低质量片段和接头序列，再运用BWA软件与UCSC数据库提供的人类基因组hg19参考序列进行比对，用GATK软件找出SNP、INDEL突变位点，突变位点用千人基因组、ESP6500、ExAC、迈基诺公司本地正常人数据库、迈基诺公司致病突变数据库、HGMD专业版数据库等进行注释。使用SIFT(http://sift.jcvi.org/)、PolyPhen 2.0(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、mutationmaster(http://www.mutationtaster.org/)预测突变对蛋白质功能的影响。使用Net-Gene2Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)预测内含子与外显子交界区碱基改变是否为剪接位点突变。依据严格的筛选标准对变异进行筛选过滤。对明确或可能与临床表型相关的基因变异，采用 Sanger 测序或其他检测方法进行验证，并进行家系分析。

2　结果

2.1患者基本资料5例患者中，男4例，女1例，年龄9～18岁；1例疑似病例，年龄2岁；父母为非近亲婚育，详细家族关系见图1。5例患者均于学龄期表现出STGD相关症状，mfERG均表现出异常，基本信息见表1。Ⅱ1，Ⅱ2眼底检查表现出蔓延至赤道部的后极部斑点，FFA表现为无脉络膜背景荧光即暗脉络膜背景或脉络膜湮没征。Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5表现为黄斑萎缩、牛眼样改变、视网膜变薄及mfERG异常。Ⅱ6年龄尚小，暂未有明显异常眼底表现。

图1　3个STGD家系图

表1　5例患者及1例疑似患者的基本信息

视力为最佳矫正视力

2.2DNA测序结果测序结果(表2)显示，3个家系中均检测到ABCA4基因异常，共检测到5个突变，均为复合杂合突变。测序图见图2～4。

表2　3个家系ABCA4基因的突变形式

A被报道与STGD相关，D、E被报道与视锥-视杆营养不良(Cone-rod dystrophy，CoRD)相关

图2　家系F1测序图

图3　家系F2测序图

图4　家系F3测序图

家系F1中,Ⅱ1和Ⅱ2存在c.2894A>G和c.101_106del，其父Ⅰ1为c.2894A>G携带者，其母Ⅰ2为c.101_106del携带者。家系F2中，Ⅱ3和Ⅱ4存在c.5899-2A>G和c.1222C>T，其父Ⅰ3为c.5899-2A>G携带者，其母Ⅰ4为c.1222C>T携带者。家系F3中，Ⅱ5和Ⅱ6存在c.1982T>G和c.101_106del，其父Ⅰ5为c.1982T>G携带者，其母Ⅰ6为c.101_106del携带者。

3　讨论

ABCA4基因位于1p22，全长约8 kb，含50个外显子，cDNA长度为6 705 bp，编码2 235个氨基酸，存在于视网膜视杆细胞外段的视盘膜中。它编码由视杆细胞外节段表达的ATP结合盒(ABC)转运蛋白(ABCR)。ABCR在视循环中负责将维生素A的中间产物N-亚视黄基-磷脂酰乙醇胺从锥体细胞外节盘膜转运到外节胞质中，其功能障碍将导致全反式视黄醛在RPE积累，全反式视黄醛会转化为A2-E，后者是脂褐素的主要组成部分，而脂褐素的毒性会损害RPE并遮盖光感受器[10-12]。迄今在ABCA4基因中已发现近900种突变，在国内早前的大样本研究中，错义突变最多(55.1%)，其次为剪切突变(17.6%)、缺失或插入突变(15.4%)、无义突变(11.8%)[13]。

本研究中5例确诊患者均发现了ABCA4基因突变，其中错义突变2个，分别为第19外显子上c.2894A>G(p.N965S)，第14外显子上c.1982T>G(p.L661R)；剪切突变1个，为第43外显子上c.5899-2A>G；缺失突变1个，为第2外显子上c.101_106del(p.34_36del)；无义突变1个，为第9外显子上c.1222C>T(p.R408X)。以上变异均不属于多态性位点，在人群中发生频率极低，并导致了ABCR蛋白功能上的改变。p.N965S是已被报道的与STGD相关的突变；余4个为新发突变，其中p.R408X和p.L661R曾被报道与CoRD相关。CoRD亦是一类严重的视网膜变性类遗传性疾病。ABCA4的变异也被认为与其他几种具有类似临床表现的黄斑疾病如视网膜色素变性和年龄相关性黄斑变性(AMD)有关，这应与其较长的基因序列和种族差异有关[6]。本研究中Ⅱ5之弟Ⅱ6由于年龄小尚未发现异常，但基因学分析得知其与Ⅱ5有相同的突变类型，有可能于青少年期表现出STGD症状。

已有的有关的STGD大样本研究结果显示，ABCA4突变的等位基因分散在整个编码序列，可能并无热点突变存在[14-17]。不过一些地区研究中，部分突变呈现出较高的突变频率，如南非人群中错义突变p.R602W(8.3%)[18]、欧洲人群中错义突变p.G1961E(20%)[14]、墨西哥人群中错义突变p.A1773V (17%)[19]、非裔美国人中错义突变p.R2107H(19.3%)[20]。在我国，p.Y808X、p.F2188S及p.N965S为检出率较高的几个突变[13]。本研究没有发现热点突变，检测出4个新突变位点，扩增了ABCA4基因的突变谱，为STGD的分子生物学研究、遗传咨询、产前诊断等提供了参考依据。

STGD虽然尚无有效的治疗方案，但有动物研究[21]表明，ABCA4-/-小鼠在黑暗环境中生长时几乎不发生脂褐素的堆积，提示避免过多光照对ABCA4基因相关的STGD患者可能有益。目前以病毒载体为代表的转基因治疗在ABCA4-/-小鼠模型上取得了一定成果[22]，治疗STGD所用的EIAV慢病毒载体对人体的安全性和疗效尚在观察中。

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