hMLH1、hMSH2、hMSH6在中青年散发性结直肠癌中的表达及对预后的影响

郑紫恒，周英发，任景丽，贾萌萌，黄丽娜，刘淑红，农文志

1)郑州大学第二附属医院消化内科 郑州 450014　2)郑州大学第二附属医院病理科 郑州 450014

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率分别位于恶性肿瘤的第2位和第4位[1-2]。散发性结直肠癌(sporadic colorectal carcinoma，SCC)约占结直肠癌总数的95%[3]，其发生发展是一个多因素、多途径的复杂过程，约85%的SCC是由于染色体的变异而导致的，但另有10%～15%的SCC则是由错配修复蛋白(mismatch repair protein，MMR)表达缺失而引起的[4]。1993年Lothe等提出了一条新的SCC发病途径——错配修复途径，其基本原理是：MMR基因保证了基因复制的高度保真，MMR基因突变将导致机体MMR蛋白功能的缺失，从而使某些突变的癌基因或抑癌基因在体内得到快速聚集，肿瘤由此发生[5]。在此途径中，hMLH1、hMSH2和hMSH6这3个MMR基因起主要作用[6-7]。近年来中青年SCC的发病率明显升高，其早期发现与诊治成为研究热点。本研究拟探讨hMLH1、hMSH2、hMSH6在中青年SCC患者中的表达情况及对预后的影响，以期为中青年SCC患者的诊疗提供依据。

1　对象与方法

1.1研究对象筛选2009年1月至2012年1月郑州大学第二附属医院病理科保存的SCC术后的石蜡标本，共96例患者纳入本研究。患者年龄25～59(46.8±10.7)岁。纳入标准：①纳入的患者均经术前病理诊断为SCC，术后再次行病理检查证实，病历资料完整。②病理分期符合美国癌症联合委员会第7版分期标准[8]，均为Ⅰ、Ⅲ期患者。其中Ⅱ期结肠癌包括以下至少一项高危因素：组织学分化差(Ⅲ或Ⅳ级)、T4、脉管浸润、术前肠梗阻/肠穿孔、标本检出淋巴结少于12枚。③化疗方案均应用FOLFOX方案，化疗均于术后8周内开始。排除标准：①Ⅰ期、Ⅳ期SCC患者。②遗传性结直肠癌。③术前进行过放化疗。④相关资料不完整。⑤术后应用其他化疗方案治疗。

1.2SCC组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达的免疫组化检测将标本用40 g/L的甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片，常规HE染色。用PV-9000二步法进行免疫组化染色。一抗为hMLH1、hMSH2、hMSH6鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，用正常的结直肠黏膜上皮作阳性对照，以磷酸盐缓冲液替代一抗作阴性对照。

1.3结果判定hMLH1、hMSH2、hMSH6均定位于细胞核[9]。免疫组化阳性判断标准参考许良中等[10]制定的《免疫组织化学反应结果的判断标准》，以细胞核出现黄褐色或棕黄色颗粒为hMLH1、hMSH2、hMSH6阳性细胞。①按染色程度进行评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②按阳性细胞所占的比例进行评分：阴性为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。其蛋白两项评分的乘积>3分判定为该蛋白表达正常，否则判定为表达缺失。以正常的结直肠黏膜上皮染色结果作阳性对照。将hMLH1、hMSH2、hMSH6中至少一项蛋白表达缺失判定为MMR蛋白表达缺失(deficient mismatch repair，dMMR)，全部蛋白表达正常定为MMR蛋白表达正常(proficient mismatch repair，pMMR)。

1.4随访对术后的患者每3个月随访1次，随访方式包括门诊及住院复查、电话随访等，对患者的化疗方案、有无复发、复发时间、生存时间等内容进行记录。随访时间为17～60个月，随访截止日期为2017年2月。无病生存期指患者术后到肿瘤复发(影像学和相关检查等的结果诊断肿瘤复发)的时间。总生存期指患者术后至任何原因导致死亡的时间。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0进行分析，计数资料比较应用χ2检验。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并行Log-rank检验，应用Cox比例风险模型进行多因素分析，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1SCC组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表达情况见图1。96例标本中，共有27例(28.1%)为dMMR，其中hMLH1表达缺失率20.8%(20/96)，hMSH2表达缺失率为8.3%(8/96)，hMSH6表达缺失率为7.3%(7/96)。仅hMLH1表达缺失16例，仅hMSH2表达缺失2例，仅hMSH6表达缺失2例；hMLH1、hMSH2同时表达缺失2例，hMSH2、hMSH6同时表达缺失3例，hMLH1、hMSH6同时表达缺失1例，hMLH1、hMSH2、hMSH6同时表达缺失1例。

A：hMLH1蛋白；B：hMSH2蛋白；C：hMSH6蛋白；1：表达缺失；2：表达正常图1　SCC组织中MMR蛋白的表达(IHC，×100)

2.2MMR蛋白的表达与中青年SCC患者临床病理特征的关系见表1。与pMMR组相比，dMMR组患者在性别、分化程度、组织学类型方面差异无统计学意义(P>0.05)；在pTNM分期、肿瘤部位、肿瘤大小、大体类型、淋巴结转移方面，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　dMMR组和pMMR组临床病理特征比较

续表1

2.3不同MMR表达状态中青年SCC患者预后的比较96例中青年SCC患者中，dMMR组5 a无病生存率为77.8%(21/27)，高于pMMR组的46.4%(32/69)，差异有统计学意义(χ2=8.955，P=0.003)。dMMR组的5 a总生存率为85.2%(23/27)，高于pMMR组的49.3%(34/69)，差异有统计学意义(χ2=12.009，P<0.001)。

2.4影响患者预后的单因素和多因素分析单因素分析结果详见表2。Cox回归变量赋值见表3。多因素分析显示：患者MMR状态、肿瘤直径为影响患者无病生存时间的危险因素，MMR状态、肿瘤直径、组织学类型为影响患者总生存时间的危险因素(P<0.05)，结果见表4、5。

表2　影响患者预后的单因素分析

表3　变量赋值表

表4　无病生存时间Cox回归分析结果

表5　总生存时间Cox回归分析结果

3　讨论

MMR基因的功能在于校正基因复制时出错的碱基，从而保持基因复制的准确性，避免基因发生突变；当细胞发生变异时，又可以介导其凋亡，避免肿瘤的发生[11]。当MMR基因发生突变或者修饰后，碱基错配得不到纠正，最终影响细胞的正常功能，导致肿瘤的发生[12]。有研究[13-16]显示，MMR蛋白的表达缺失与微卫星不稳定( microsatellite instability，MSI)呈明显正相关，而MSI的存在则预示着更好的预后。近些年，结直肠癌的发病趋于年轻化，分析MMR在中青年SCC患者中的作用显得尤为重要。

本研究结果显示，MMR的表达缺失率达28.1%，明显高于其在SCC中总的表达缺失率(10%～20%)[17]，提示MMR或许是影响结直肠癌年轻化的一项重要因素。

此前，多项研究[18-20]表明，MMR的表达缺失与肿瘤部位、pTNM分期、分化程度、病理类型相关。本研究发现，在中青年SCC患者中，同样存在类似现象，如MMR在右半结肠、Ⅱ期、肿瘤直径≥5 cm、溃疡型和浸润型的患者中表达缺失率更高。此外，作者还发现，dMMR组的患者发生淋巴结转移的比例要比pMMR组低，这与韩国国立癌症中心的Park[21]教授团队的研究结果一致，这或许可以解释dMMR组患者预后反而更好。

Sinicrope 等[22]回顾性分析了2 580例Ⅲ期SCC患者，应用术后辅助化疗的dMMR组患者预后更好。此外，Sinicrope等[22-23]还认为，以5-FU为基础的化疗可以延长患者的生存期，提高患者5 a生存率。也有一些不同的观点[24-25]认为，dMMR 患者无法从以5-FU为基础的化疗方案中获益，对Ⅱ期dMMR 患者甚至有害。关于MMR影响SCC患者预后的机制，众多学者对其有不同的看法。Scarpa等[26]认为，MLH1、MSH2和MSH6的缺失增强了SCC患者的免疫监视功能。Wendum等[27]则认为，这可能与血管内皮生长因子水平和微血管密度有关。

本研究发现，dMMR同样是中青年SCC患者预后的生物学指标。dMMR组的5 a无病生存率及总生存率均高于pMMR组，差异有统计学意义。这与Tournigand等[28]的研究结论一致。因此，对于中青年具有高危因素的Ⅱ期及Ⅲ期SCC患者，建议应进行术后辅助化疗。单因素和多因素回归分析显示，MMR状态为影响患者预后的危险因素。考虑到pTNM分期和组织学类型可能会影响到患者的预后，因此将他们同样纳入多因素分析，结果显示：pTNM分期与患者的预后无关；组织学类型不会影响患者的无病生存时间，而会影响患者的总生存时间。

本项研究的优点主要有：①化疗方案的选择，既往研究多以5-FU单药或联合亚叶酸钙治疗，或化疗方案不固定，而本研究纳入的患者则均应用FOLFOX方案，故作者认为加入奥沙利铂可能有助于消除5-FU对患者的消极影响。②纳入标准严格，纳入的患者均为中青年Ⅱ和Ⅲ期SCC患者，且Ⅱ期患者具有至少一项高危因素。本研究的不足之处在于样本量仍然较少，亚组分析时病例数更少，有待大样本验证上述结论。

综上所述，中青年SCC患者MMR蛋白的表达状态与其临床病理特征及预后有明显的相关性，MMR表达缺失更多见于Ⅱ期、右半结肠、肿瘤直径≥5 cm、溃疡型和浸润型、无淋巴结转移的患者；MMR状态为影响患者预后的危险因素。

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