miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宫颈癌中的表达研究

沈树娜，王　辉，宫本丽

(内蒙古医科大学第三附属医院妇产科，内蒙古 包头 014010)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，细胞周期的失控与肿瘤的发生有着明显的相关性[1-2]。miRNA是广泛存在于真核生物体中的一组内源性非编码单链小分子RNA，其中微小核糖核酸29(microRNA，miRNA29)在多种恶性肿瘤中低表达，其通过靶向细胞周期素D2重组蛋白(recombinant cyclin D2，CCND2)和周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinases，CDK6)参与细胞周期的调控和宫颈癌的发生发展[3-4]，本实验采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测宫颈鳞状细胞癌组织中CCND2、CDK6表达情况并分析了二者在宫颈癌发生发展中的相互作用。

1材料与方法

1.1材料

收集2015年6月至2017年1月内蒙古医科大学第三附属医院妇科宫颈癌手术切除标本20例，因宫颈上皮内瘤变子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)行宫颈锥切标本24例，因子宫肌瘤行全子宫切除标本 20例，所有病例均经病理确诊。宫颈癌(病理结果均为宫颈鳞状细胞癌)患者术前均未接受放化疗，按年龄可分为：≥40岁16例，<40岁4例；按临床分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期14例；按有无淋巴结转移可分为：有淋巴结转移者2例，无淋巴结转移18例；按病理组织学分级可分为：中、低分化9例，高分化11例。

1.2研究方法

实验中新鲜标本均经病理医师取材，收取组织在术中离体后马上收取，立即予生理盐水漂洗去除血迹，置于组织凉存管，立即放入液氮速冻，然后移至冰箱保存直至使用。采用RT-PCR 检测宫颈鳞状细胞癌组织、CIN组织、正常宫颈组织中CCND2、CDK6的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)水平。

1.3统计学方法

采用Sigma State软件对数据进行统计学处理，多组计量资料比较采用Kruskal-Wallis检验，两组比较采用Mann-Whitney 检验。CCND2和CDK6相关性分析采用Spearman相关分析。采用双侧检验，检验水准为α=0.05，P<0.05，差异有统计学意义。

2结果

2.1 miRNA29靶基因CCND2在三组中的表达

miRNA29靶基因CCND2在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈鳞状细胞癌组织中的相对表达量平均值为0.00140859、0.00204650、0.01702534。经统计学分析，CCND2在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达水平与CIN组织相比显著上调，差异有统计学意义(U=60.00，P<0.05),在正常宫颈组织与CIN组织的表达水平相比，差异无统计学意义(U=184.00，P>0.05),在宫颈鳞状细胞癌组织的表达水平与宫颈正常上皮组织相比显著上调，差异有统计学意义(U=16.00，P<0.05)。结果见表1和图1。

表1CCND2在正常宫颈组织、CIN组织、宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

Table 1Expressions of CCND2 in normal cervical tissues, CIN tissues and tissue of cervical squamous cell carcinoma

编号分组例数(n)CCND2平均值HP1UP21宫颈鳞状细胞癌组200．0170253460．00<0．05∗2CIN组240．0020465029．27<0．05184．00>0．05∗∗3正常宫颈组200．0014085916．00<0．05∗∗∗

注：P1为三组间比较，P2为两组间比较；*为1、2组比较，**为2、3组比较，***为1、3组比较。

2.2 miRNA29靶基因CDK6在三组中的表达

miRNA29靶基因CDK6在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈鳞状细胞癌组织中的相对表达量平均值为0.00104340、0.00028625、0.00066675，CDK6在正常宫颈组织、CIN组织、宫颈鳞状细胞癌组织中表达无统计学差异(H=2.76，P>0.05)。结果见表2，图1。

表2CDK6在正常宫颈组织、CIN组织、宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

Table 2Expressions of CDK6 in normal cervical tissues, CIN tissues and tissue of cervical squamous cell carcinoma

编号分组例数(n)CDK6平均值HP1宫颈鳞状细胞癌组200．000666752CIN组240．000286252．76>0．053正常宫颈组200．00104340

图1宫颈鳞状细胞癌组织中CCND2、CDK6 PCR产物电泳图

Fig.1Electrophoretogram of PCR production of CCND2 and CDK6 in cervical squamous cell carcinoma tissue

2.3 miRNA29靶基因CCND2和CDK6在宫颈癌发生发展过程中的相关性

采用Spearman相关分析分别结果显示：在CIN组织中,CCND2与CDK6表达呈正相关，结果有统计学意义(r=0.58，P<0.05)，宫颈鳞状细胞癌组织中CCND2和CDK6相关性分析，无统计学意义(P>0.05)。

2.4 miRNA29调控的CCND2在宫颈癌组织不同临床病理特征方面比较

进一步分析宫颈鳞状细胞癌组织中CCND2表达与患者临床病理特征的关系，发现CCND2表达与宫颈鳞状细胞癌患者的病理分化程度方面的差异具有统计学意义(P<0.05) ；淋巴结转移方面因分布不均而无法比较。而在FIGO分期、年龄方面的比较差异无统计学意义(P>0.05) ，见表3。

表3宫颈鳞状细胞癌组织中CCND2的表达与临床病理特征的关系

Table 3Relationship between the expression of CCND2 and clinicopathological features incervical squamous cell carcinoma tissue

临床病理特征例数(n)CCND2平均值UP年龄(岁)　≥40140．0195724839．00>0．05　<4060．01108203淋巴结转移　阳性20．02367749--　阴性180．01628622FIGO分期　Ⅰ60．0100217423．00>0．05　Ⅱ140．02002689组织分化程度　高分化110．0074172923．00<0．05　中、低分化90．028768521

2.5 miRNA29靶基因CCND2在CIN组织中的表达

CIN组分为两组：CINⅠ/Ⅱ组、CINⅢ组。结果显示，CCND2在CINⅢ组中的表达明显高于CINⅠ/Ⅱ组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4CCND2在CIN组织中的表达

Table 4Expression of CCND2 in CIN tissue

组别例数(n)CCND2平均值UPCINⅠ/Ⅱ130．001176324．00<0．05CINⅢ110．00327582

3 讨论

3.1miRNA29与恶性肿瘤

miRNA29是miRNA中的成员之一，在多种癌症中异常表达，如乳腺癌、胃癌、宫颈癌等。miRNA29通过靶向CCND2参与细胞周期的调控，抑制宫颈癌的发生，宫颈癌组织中CDK6是miRNA29是靶基因，通过调控细胞周期参与宫颈癌的发生。

3.2 CCND2与宫颈肿瘤

CCND2是D型细胞周期蛋白的成员，其在细胞周期调节，分化和恶性转化中起关键作用[4]。邹冬玲等[5]发现CCND2在宫颈癌组织中表达上调，且发现miRNA29通过靶向CCND2参与宫颈癌的发生发展。本研究结果表明，与正常宫颈组织、CIN组织相比，宫颈鳞状细胞癌组织中CCND2的表达水平上调，差异有统计学意义，且与病理分级有关；在正常宫颈组织和CIN组织中CCND2表达水平比较，差异无统计学意义。而在CIN中的CINⅠ/Ⅱ组、CINⅢ组中的表达存在差异，差异具有统计学意义。本实验结果说明miRNA29靶基因CCND2在早期宫颈病变中(CINⅠ/Ⅱ组)无显著异常表达，随着宫颈病变的进展发挥作用，可能促进肿瘤细胞生长，由于病理分级是恶性肿瘤预后的重要指标，因此CCND2在判断宫颈癌的预后评估中具有较为重要的临床意义。

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3.3 CDK6与宫颈肿瘤

CDK6是CDK家族中的一员，在丝裂原诱导下，与细胞周期蛋白 D 结合，参与细胞周期的调节。目前已发现，多种肿瘤存在CDK6 基因扩增、过表达或细胞周期抑制因子缺乏、突变导致的 CDK6活性增强[6]。miRNA29可能是与HPV致癌过程关系最为密切的miRNA，可能通过细胞周期等生物学功能参与HPV相关的宫颈癌发生过程，提示miRNA29可能是宫颈鳞状细胞癌相关的抑癌miRNA。王辉等[7]研究通过免疫组化发现CDK6的蛋白水平在宫颈癌组织中的表达明显上调。而本实验结果显示在正常宫颈组织、CIN组织、宫颈鳞状细胞癌组织中表达比较，差异无统计学意义，与文献报道不一致。该结果的出现可能因为CDK6仅是较大细胞周期、信号传导系统的一部分，且本研究存在样本量不足等缺陷，因而需进一步扩大样本量及定量测试蛋白水平以确定miRNA29靶基因CDK6在宫颈癌发生发展中的作用。

3.4 CCND2和CDK6在宫颈肿瘤中的相关性

本研究通过RT-PCR测试CCND2和CDK6在宫颈癌已经CIN组织中的表达，并通过统计学方法分析其相关性。结果示CCND2和CDK6的表达水平在宫颈鳞状细胞癌组织中无相关性，而在CIN组织中存在正相关，说明miRNA29靶基因CCND2和CDK6在CIN组织中可能起协同作用，为进一步探索miRNA29在宫颈癌发生发展中的机制，本研究下一步可在大样本量的前提下继续研究检测，随着宫颈癌的发生发展，研究miRNA29靶基因CCND2及CDK6的关系，以进一步探索miRNA29在宫颈癌发生发展中的机制，可为miRNA29可成为宫颈癌诊断和治疗的一个新靶点提供一定的理论依据。

[参考文献]

[1] Li Y, Liu J, Liu Z Z,etal. MicroRNA-145 inhibits tumour growth and metastasis in osteosarcoma by targeting cyclin-dependent kinase, CDK6[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2016,20(24):5117-5125.

[2]Zhu K, Liu L, Zhang J,etal. MiR-29b suppresses the proliferation and migration of osteosarcoma cells by targeting CDK6[J]. Protein Cell, 2016,7(6):434-444.

[3]朱红琴.周期蛋白依赖性激酶6与肿瘤和细胞分化[J].生命的化学,2009,28(1):52-55.

[5] 邹冬玲,王冬,周琦.微RNA-29b通过调控cyclin D2表达参与宫颈癌发生的机制研究[J]. 肿瘤,2014,34(12):1090-1096.

[6]Handschick K, Beuerlein K, Jurida L,etal. Cyclin-dependent kinase 6 is a chromatin-bound cofactor for NF-κB-dependent gene expression[J]. Mol Cell, 2014, 53(2):193-208.

[7]王辉,沈树娜,王俊飞.宫颈癌组织中CDK6的表达及临床意义[J].中国现代医学杂志,2013,23(34):60-62.