同卵双生子甄别研究进展

徐倩南，李成涛 ，刘希玲

（1.温州医科大学法医学系，浙江 温州 325035；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

同卵双生子是受精卵在卵裂时，由于自身或外界某些随机因素导致其一分为二从而形成两个相同的胚胎发育而成的，因此，同卵双生子理论上具有相同的遗传信息，运用传统的遗传标记，包括短串联重复（short tandem repeat，STR）序列、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入/缺 失（insertion/deletion，InDel），均不能将其区分。尽管同卵双生子在理论上应该具有完全相同的遗传信息，但是两者即使在成长环境大致相同的情况下常显示出明显的表型差异，这些差异是由环境或其他因素综合造成的。同卵双生子在表观遗传水平以及基因组序列等方面存在一定差异，这为同卵双生子的甄别提供了坚实的理论基础。本文就这些方面的进展进行详细介绍。

1 表观遗传学差异

表观遗传学是与遗传学相对立的概念，是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、X染色体失活等。早在十几年前，FRAGA等[1]观察了DNA甲基化和组蛋白修饰在同卵双生子中的改变，指出同卵双生子在这两种表观遗传标志中均存在差异，而且这种差异随着个体年龄的增长越来越明显，这可能是由于同卵双生子共同生活的时间较短、生活方式不同以及其他环境因素的影响造成。之后，诸多科学家以同卵双生子为研究对象就表观遗传如何影响个体表型的分子机制进行了详细探讨。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，是指在DNA甲基化转移酶的催化下，将甲基选择性地添加在DNA分子中的G、C两个核苷酸上[2]。DNA甲基化将导致DNA构象变化，从而影响蛋白质与DNA的相互作用，其甲基化程度与基因表达水平呈负相关，是基因表达的调节方式之一，也是造成个体表型差异的重要原因之一[1]。已有多项研究证实了同卵双生子间存在明显的DNA甲基化水平差异。

2005年，FRAGA等[1]为了探索同卵双生子表型差异的潜在分子机制，从DNA甲基化、X染色体失活以及组蛋白乙酰化三方面比较了40对同卵双生子之间的差异，使用甲基化间区位点扩增（amplification of inter-methylated sites，AIMS）技术研究DNA甲基化差异时，发现0.5%～35%的AIMS条带（3～210条）在同卵双生子对中存在条带缺失不一致的现象，其差异位点覆盖了从染色体终端到单拷贝基因启动子区域的CpG岛等区域。2008年，KURATOMI等[3]利用甲基化敏感性代表性差异分析（methylation sensitive-representational difference analysis，MS-RDA）策略对一方患双相情感障碍（bipolar disorder，又称躁郁症）、一方正常的同卵双生子对中的淋巴细胞进行DNA甲基化扫描，结果显示，四个区域存在DNA甲基化异常，分别为PPIEL、PIP5KL1、SMS和ARMC3。2011年，COOLEN等[4]采用MassCLEAVE检测方法调查了128对同卵双生子和128对异卵双生子印记控制区域（imprint control region，ICR）中IGF2、H19、KCNQ1、GNAS基因以及非印迹基因RUNX1/AML1的甲基化信息，发现在两种类型双生子中H19和IGF2甲基化水平均存在显著差异。MIYAZAKI等[5-7]在一方正常、一方患其他疾病的同卵双生子对中研究DNA甲基化水平的差异，也发现了DNA甲基化修饰在具有不同类型表型差异的同卵双生子之间普遍存在的现象。2013年，LI等[8]在全基因组水平上，通过Illumina公司的Human-Methylation27 BeadChip芯片对22对成年健康同卵双生子血液样本中的DNA甲基化水平进行了全基因范围内的扫描，筛选出近百个差异明显的CpG位点，进一步提示了DNA甲基化在甄别同卵双生子方面的价值。此后，针对同卵双生子DNA甲基化差异所在位置也展开了深入探讨。2014年，van DONGEN等[9]通过对同卵双生子口腔上皮细胞进行全基因组DNA甲基化分析后发现，同卵双生子在CpG岛外的CpG位点甲基化水平更趋向于有差异。而ZHANG等[10]在2015年采用Infinium HumanMethylation450 BeadChips芯片技术对10对成年健康同卵双生子个体进行分析后发现，位于CpG岛上的甲基化位点其甲基化水平在同卵双生子之间也存在明显差异。

值得注意的是，基于位点DNA甲基化程度，使用智能神经网络模型以及新一代测序技术对人类年龄进行预测具有可行性。VIDAKI等[11]基于Illumina公司的甲基化芯片对1 156名2～90岁的个体进行DNA甲基化水平分析，使用逐步回归法从45个与年龄相关的CpG位点中选取了23个与年龄显著相关的位点，并通过广义回归神经网络模型（generalized regression neural network model）对这些位点预测年龄的模型进行优化，采用优化后的模型对51对同卵双生子和1011个无关个体年龄进行预测，误差分别为7.1岁和7.2岁。与前期研究结果[10]一致，上述这些研究显示了DNA甲基化会随着人体年龄的改变而变化，这在DNA甲基化实际应用于同卵双生子甄别时应引起注意。

总体来说，DNA甲基化已被证实在同卵双生子之间存在明显差异，因而对甄别同卵双生子具有重大应用价值，但发生DNA甲基化修饰变化的热点区域和DNA甲基化修饰水平在不同组织、人群、时间中的稳定性以及成熟的DNA甲基化位点检测系统仍有待研究和开发。

1.2 X染色体失活

X染色体失活是指在胚胎发育早期，雌性哺乳动物细胞中两条X染色体之一失去活性的现象，是哺乳动物X染色体基因剂量补偿作用的实现方式，这一过程被认为是由长非编码RNA Xist诱导产生[12]。失活的X染色体伴随着一系列的表观遗传修饰，其中包括组蛋白和DNA甲基化以及组蛋白去乙酰化等，这对失活起始和失活状态维持起着必不可少的作用[13]。X染色体失活通常可以通过X染色体上DNA甲基化修饰状态差异[14]或者基因表达活性差异[15]来推测。

作为一种X连锁隐性遗传疾病，红绿色盲的发生机制受到了众多科学家的关注。早在1992年，JØRGENSEN等[16]对同卵双生子是否患红绿色盲与X染色体失活的关系进行探讨，通过采集一方患红绿色盲、一方健康的同卵双生子以及其家属样本，利用Southern blot技术分析了色素基因（pigment genes）在样本中的基因型，并使用M27β探针推测X染色体甲基化状态，结果发现，在女性同卵双生子中，患红绿色盲个体的父源X染色体存在活性（其父亲也是红绿色盲患者），健康个体母源X染色体存在活性。同样的，在1996年，REDONNET-VERNHET等[17]研究同卵双生子中法布里病（Fabry disease）的发生情况时，也发现了患病个体中父源X染色体存在活性，正常个体母源X染色体存在活性的现象，并指出此种差异可能是由内细胞团的不均等分裂导致的。2000年，WILLEMSEN等[18]研究了女性同卵双生子X染色体FMR1基因突变与一种精神发育迟滞疾病[脆性X综合征（fragile X syndrome）]发病情况的联系。通过对发根中脆性X精神发育迟缓蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）基因表达情况进行检测，发现在患有精神发育迟滞的男性同卵双生子中FMR1基因存在序列突变，从而导致FMRP表达增高。对女性而言，只有60%携带有突变FMR1基因的同卵双生子表现为智力低下，这与突变FMR1基因所在X染色体是否失活相关，并且指出X染色体失活发生在受精卵分裂之后。为了检测X染色体失活对其他类型精神疾病的影响，2008年ROSA等[19]评估了X染色体失活对双相情感障碍和精神分裂症的影响。通过对表型不一致的女性同卵双生子个体口腔黏膜细胞和外周血中人雄激素受体甲基化差异研究发现，在双相情感障碍中，表型不一致的同卵双生子在父源或母源X染色体上DNA甲基化水平的差异更大，这提示X染色体失活或许与同卵双生子表型不一致相关。除了上述研究外，硬皮病（scleroderma）[20]、原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）[21]等疾病也被发现与X染色体失活密切相关。

以上研究不仅为某些复杂疾病的发病机制、病因和早期干预治疗指明了方向，其在同卵双生子对间发现的明显差异也为甄别女性同卵双生子提供了一种新思路。上述研究均在疾病表型不一致的同卵双生子对之间开展，然而不管其表型是否一致，女性同卵双生子拥有的相同父源X染色体和母源X染色体在受精卵早期分裂发育成两个胚胎后就会发生X染色体随机失活的现象[17，22-24]。这一过程将有可能导致女性同卵双生子对间失活的X染色体存在差异，即一方父源X染色体失活，另一方母源X染色体失活。目前与X染色体失活相关的检测位点十分有限，其检测效率也有待考验，大规模化检测系统也有待完善。值得注意的是，在男性个体中，X染色体不存在失活现象（除生殖细胞外）[25]，因此该方法无法对男性同卵双生子个体进行区分，这也使得这一方法用于甄别同卵双生子的使用范围十分有限。此外，X染色体失活在一些组织间的异质性也将影响这一方法在同卵双生子之间的应用[15]。

2 拷贝数变异

拷贝数变异（copy number variation，CNV）是一种长度从1kb到数Mb的DNA片段拷贝数变异，主要包括DNA片段的扩增、缺失、插入、倒置等[26]。CNV是基因组结构变异的一种重要形式。在人类基因组中，发生CNV的区域约占基因组总长度的12%[26]。CNV可导致不同程度的基因表达差异，对正常表型的构成及疾病的发生发展具有一定影响[27-29]。

2008年，BRUDER等[28]以19对同卵双生子（包括10对健康同卵双生子）作为研究对象，使用32K BAC Array和Illumina HumanHap300 Duo BeadChip两大芯片对外周静脉血中DNA的CNV进行检测，结果发现，无论表型是否一致，同卵双生子中均存在CNV。2012年，VEENMA等[30]检测了在先天性膈疝和食管闭锁两种疾病中具有表型差异的同卵双生子中的CNV，结果在食管闭锁组发现10个生殖细胞系（germ-line）CNV。2015 年，ABDELLAOUI等[29]使用Affymetrix 6.0芯片对1 097对0～79岁同卵双生子的血液或口腔拭子进行分析，共发现556个CNV，其中超过10%的同卵双生子共同拥有的CNV有153个。这项研究也评估了不同组织来源的DNA中检测到的CNV的一致性，结果发现，来源不同的DNA中CNV的一致性存在显著的差异。

从以上研究可以看出，同卵双生子之间存在明显的CNV差异，这为使用CNV甄别同卵双生子提供了坚实的理论基础。此外，CNV的检测方法也日趋成熟，不管是利用芯片以及高通量测序等技术完成CNV的大规模筛查，还是对于一些热点CNV进行低通量检测，这为后续的研究提供了一定的技术支持。对于CNV是否可以作为甄别同卵双生子的有效手段，还有待于深入研究，比如比较不同人群中CNV的分布、CNV在不同组织以及不同环境下的稳定性等。

3 microRNA表达

microRNA（miRNA）是一类内源性的、长度为19～24个碱基的非编码小分子RNA。miRNA在基因的转录后调控等方面发挥了重要作用。miRNA由于片段、序列比较保守而具有不易降解以及表达具有时空特异性等特点。已有研究证实，miRNA表达水平在同卵双生子之间存在差异，这提示了miRNA在同卵双生子的甄别中具有应用价值。

2007年，PERKINS等[31]分析了精神分裂症与健康个体之间12个miRNA在前额叶皮质中的表达情况，结果显示，具有表型差异的个体之间miRNA的表达也存在差异。之后，KIM等[32]对精神分裂症和双相情感障碍患者前额叶皮质中的miRNA表达进行了研究，运用基于TaqMan低密度芯片（TaqMan low-density array，TLDA）的实时荧光定量PCR对667个miRNA的表达进行定量检测，发现在精神分裂症和双相情感障碍中分别有7个和15个miRNA表达量存在差异，进一步提示了个体表型差异与miRNA表达之间的关系。2010年，SARACHANA等[33]采用miRNA基因芯片技术在患自闭症表型不一致的同卵双生子中分别检测到miR-23a在患者中呈高表达，而miR-106b呈低表达。利用同样的技术，在慢性肝衰竭急性发作表型不一致的同卵双生子的研究中，也观察到hsamiR-16和hsa-let-7a的表达会加速病程发展[34]。

如上所述，miRNA表达检测方法十分成熟，由于其不易降解以及表达具有时空特异性等特点，使得其在法医学上的应用不仅仅局限于同卵双生子识别。事实上，已有大量研究显示，miRNA在法医学年龄推断以及体液（斑）来源鉴定上具有广阔的应用前景[35-37]。但是，miRNA的时空表达特异性也决定了其在同卵双生子甄别应用中的局限性。

4 抗体库差异

在脊椎动物适应性免疫系统中，个体在发育过程中根据接触的不同抗原会经过基因重组产生不同的抗体，形成自己特异的抗体库基因。尽管理论上认为同卵双生子的基因组一致，但后天的生活环境必然会存在差异，也会由于接触不同抗原而导致抗体库不一致。抗体库基因差异被认为极有可能成为识别同卵双生子的手段之一。早在1993年，DUNLAP等[38]便以同卵双生子和异卵双生子作为研究对象观察遗传因素对抗体的影响，取血清为样本，采用固相酶联免疫吸附试验测定IgG、IgM、IgA抗体水平，抗体的遗传特性由TWINAN90进行分析，结果显示，IgM受到基因的独立调控，而IgG和IgA受基因调控和环境因素双重影响，这说明抗体的产生不仅仅与遗传因素相关，也受到环境因素的影响，因而理论上遗传物质相同的同卵双生子可能拥有不同的抗体。到1995年，MCHUGH等[39]针对硬皮病这一自身免疫性疾病进行了关于同卵双生子中抗体差异的研究，以血清为样本，由35S标记的细胞系通过免疫荧光、免疫扩散、免疫沉淀方法对抗体进行检测，结果在患有硬皮病的个体中发现抗多发性肌炎硬皮病抗体、抗苏氨酰tRNA合成酶抗体和抗拓扑异构酶Ⅰ抗体，而在正常个体中未发现，研究指出，同卵双生子之间的抗体差异可能与基因重排、RNA随机剪接、体细胞突变相关。此后多位学者对同卵双生子之间的抗体差异进行了进一步探讨。如2009年，GOUW等[40]对患有血友病A的同卵双生子治疗过程中表现出的、关于凝血因子Ⅷ的抗体差异进行了分析，以外周血为样本，采用酶联免疫吸附测定抗体滴度，发现同卵双生子中凝血因子Ⅷ抗体IgG1和IgG4的含量存在差异。NINFEA等[41]对同卵双生子抗磷脂抗体导致的血小板减少临床表现的差异进行了案例报道，在进行静脉注射免疫球蛋白和后续的利妥昔单抗治疗后，同卵双生子中的一方未发现血栓形成，而另一方则出现了肺血栓以及深静脉血栓形成等需要抗凝治疗的症状。这些现象均提示同卵双生子之间抗体在种类和滴度方面存在差异。2013年，SVENDSEN等[42]针对27对同卵双生子和51对异卵双生子类风湿性关节炎发病具有差异的情况进行了研究，以外周血为样本，采用酶联免疫吸附测定类风湿因子IgM、IgA以及抗环瓜氨酸肽抗体，采用间接免疫荧光法测定Keratin抗体，并对抗环瓜氨酸肽抗体进行了多元线性回归分析，结果显示，同卵双生子中抗环瓜氨酸肽抗体是决定个体是否患病的重要危险因子。HENSVOLD等[43]以12 590对双生子作为研究对象，其中包括10 002对完整双生子（28%为同卵双生子，72%为异卵双生子）和2588个只有一方参加的双生子对，以外周血为样本，采用酶联免疫吸附试验对抗瓜氨酸抗体进行检测，采用二项逻辑回归模型对抗瓜氨酸抗体阳性与性别、年龄、吸烟状况、吸烟类型、共同表位等位基因的存在及其数量之间的关系进行了分析，发现在未患类风湿性关节炎的情况下，抗瓜氨酸抗体在同卵双生子中的一致率为3.7%。

综上所述，抗体库差异的检测将很有可能成为甄别同卵双生子的有效手段。目前关于抗体在同卵双生子中差异的研究大多与疾病发生机制相关，对于其在法医学中的应用还有待开展。其次，抗体库种类多、易变化，目前也缺乏系统的检验方法，其可行性还有待于进一步研究。

5 展 望

理论上同卵双生子拥有相同的基因组DNA，使用传统的生物学检测方法很难将其区分，这使得涉及同卵双生子的案件由于无法区分犯罪者而常常不能告破，因此开发同卵双生子甄别的有效方法是法医学领域迫切需要解决的问题。

前期研究发现DNA甲基化修饰、X染色体失活、CNV、miRNA表达活性、抗体库均在同卵双生子对中出现了差异，然而这些研究涉及的双生子对大多数为一方患有疾病，而在健康同卵双生子对中开展的研究较少。作为甄别同卵双生子的遗传标记，需要具备较好的稳定性、良好的多态性等，并且具有完备便捷的检测系统和计算方法。因此，在健康同卵双生子中的实验有待进一步开展，对这些遗传标记在不同条件下的稳定性也有待评估，筛选出一种稳定的、可区分同卵双生子的遗传标记并开发出一套完整便捷的计算检测方法，将成为未来甄别同卵双生子的主要任务之一。